Исследования безопасности, иммуногенности и протективности вакцины «Гам-VLP- Рота» для профилактики ротавирусной инфекции на релевантной модели животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Филатов Илья Евгеньевич

• Филатов Илья Евгеньевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Филатов Илья Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристика ротавирусов

1.2 История открытия ротавирусов

1.3 Эпидемиология и генотипическое разнообразие ротавирусов

1.4 Иммунный ответ при ротавирусной инфекции

1.5. История разработки и современное состояние вакцин против ротавирусной инфекции

1.6 ПерспективыVLP-вакцин против ротавирусной инфекции

1.7 Использование животных моделей в исследованиях вакцин против ротавирусной инфекции

1.8 Доклинические испытания ротавирусных вакцин: методы и критерии оценки

ВЫВОДЫ ПО ЛИТЕРАТУРНОМУ ОБЗОРУ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.1 Вакцина «Гам-VLP-Рота»

2.1.2 Вирус

2.1.3 Клетки

2.1.4 РВА-специфические сыворотки мышей

2.1.5 РВА-специфические сыворотки свиней

2.1.5 РВА-специфические сыворотки морских свинок

2.2 Методы

2.2.1 Получение и очистка рекомбинантных VP2VP6 белков

2.2.2 Определение инфекционности рекомбинантного бакуловируса

2.2.3 Электронная микроскопия

2.2.4 Методика электрофореза и иммуноблотинга

2.2.5 Определение концентрации белка

2.2.6 Метод ИФА для выявления антител к ротавирусу

2.2.7 Реакция нейтрализации

2.2.8 Реакция бласттрансформации лимфоцитов

2.2.9 Метод ОТ-ПЦР в реальном времени

2.2.10 Регистрация массы тела поросят

2.2.11 Регистрация температуры тела поросят

2.2.12 Методы оценки гематологических показателей крови поросят

2.2.13 Методы оценки биохимических показателей крови поросят

2.2.14 Методы оценки биохимических показателей крови крыс

2.2.15 Заражение, отбор ректальных мазков, эвтаназия поросят

2.2.16 Статистическая обработка

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Разработка тест-системы ИФА для оценки гуморального иммунного ответа у животных

3.1.1 Получение рекомбинантных белков УР2УР6

3.1.2 Очистка рекомбинантных белков УР2УР6

3.1.3 Определение чистоты и специфичности рекомбинантных белков УР2/УР6

3.1.4 Электронная микроскопия рекомбинантных белков УР2УР6

3.1.5 Сравнение УЬ? УР2/УР6 с рек-УР6 при использовании в качестве антигена для ИФА

3.1.6 Результаты оценки иммунного ответа у новорожденных карликовых свиней

3.1.7 Определение чувствительности и специфичности тест-системы ИФА

3.2 Разработка и валидация методики оценки специфической активности вакцины «Гам-УЬ?-рота»

3.2.1 Выбор модели животных и схемы иммунизации

3.2.2 Валидация методики определения специфической активности вакцины «Гам-УЬ?-рота»

3.3 Исследование безопасности, иммуногенности и протективной активности вакцины «Гам-УЬР-рота» на модели карликовых свиней

3.3.1 Результаты исследования безопасности вакцины на модели карликовых свиней

3.3.1.1 Динамика изменения массы тела поросят

3.3.1.2 Динамика изменения температуры тела поросят

3.3.1.3 Результаты гематологического анализа крови поросят

3.3.1.4 Результаты биохимического анализа крови поросят

3.3.2 Результаты исследования острой токсичности на модели крыс SD

3.3.2 Результаты исследования иммуногенности вакцины

3.3.2.1 Результаты определения IgG антител в сыворотках крови свиней

3.3.2.2 Результаты определения IgA антител в сыворотках крови свиней

3.3.2.3 Результаты определения вируснейтрализующих антител в сыворотках крови свиней

3.3.2.4 Результаты оценки клеточного иммунитета

3.3.2.5 Результаты оценки секреторного иммунитета

3.3.3. Результаты оценки протективных свойств вакцины

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследования безопасности, иммуногенности и протективности вакцины «Гам-VLP- Рота» для профилактики ротавирусной инфекции на релевантной модели животных»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Среди иммунобиологических лекарственных средств вакцины на основе вирусоподобных частиц (Virus-like particles, VLP), отличаются благоприятным профилем безопасности [1]. VLP имеют олигомерную структуру из многих отдельных полипептидов, складывающихся в частицу с размерами более 50 нм и не содержат нуклеиновых кислот [2]. VLP имитируют структуру живого вируса и, следовательно, имеют характерные эпитопы [3]. В мировой практике созданы и внедрены вакцины для профилактики гриппа А [4], гепатита В [5], папилломавирусной [6]. Одним из перспективных направлений в фармации является создание иммунобиологического лекарственного средства на основе VLP для профилактики ротавирусной инфекции. Исходя из данных Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) клинические проявления ротавирусной инфекции, а именно, острый гастроэнтерит, сопровождающийся тяжелой диареей и ведущий к тяжелой дегидратации организма, является одной из ведущих причин смертности детей до 5 лет [7]. Специфического лечения нет, поэтому наиболее эффективным методом борьбы с ротавирусной инфекцией (РВИ) является вакцинопрофилактика. В России для иммунизации всегда применялись только импортные вакцины, такие как Рота^-Эйд (Serum Institute of India, Индия), Ротатек (Merck sharp&Dohme, LLC, США), Ротарикс (GlaxoSmithKline B iologicals, s.a., Бельгия). Все вакцины для профилактики ротавирусных гастроэнтеритов -живые, поэтому могут приводить к тяжелому осложнению - инвагинации кишечника [8].

Ранее была разработан экспериментальный прототип вакцины на основе вирусоподобных частиц для профилактики ротавирусной инфекции [9]. Представленное исследование направлено на доклиническое изучение безопасности, иммуногенности и протективности вакцины на основе вирусоподобных частиц «Гам-VLP-рота на релевантной модели новорожденных

карликовых свиней и разработку чувствительного и специфичного метода определения антител различных классов к РВИ.

Степень разработанности темы исследования. Разработан новый отечественный иммунобиологический лекарственный препарат - вакцина Гам-УЬР-рота на основе инновационной платформы для профилактики ротавирусной инфекции. Антиген вакцины представляет собой смесь трехслойных вирусоподобных частиц, имитирующих вирион ротавируса. При этом поверхностные антигены представлены 6-ю актуальными генотипами, циркулирующими на территории Российской Федерации. В представленном исследовании разработаны и стандартизированы методы контроля готовой формы вакцины и оценена безопасность и иммуногенность, а также протективные свойства препарата на релевантной животной модели.

Объект исследования. В рамках диссертационной работы объектом исследования являлась вакцина «Гам-УЬР-Рота» для профилактики ротавирусной инфекции.

Предмет исследования. Разработка и валидация методик оценки свойств вакцинного препарата.

Цель исследования: Оптимизация и стандартизация методов контроля безопасности, иммуногенности, протективности вакцины «Гам-УЬР-рота» для профилактики ротавирусной инфекции на основе УЬР.

Задачи исследования:

1. Разработать специфичную и чувствительную тест-систему на основе иммуноферментного анализа для определения антител к ротавирусу А у различных животных.

2. Разработать и валидировать методику контроля вакцины «Гам -УЬР-рота» по показателю «Специфическая активность» при его производстве на модели морских свинок.

3. Исследовать безопасность вакцинного препарата «Гам-УЬР-рота» по динамике изменения массы и температуры тела, а также исследованию

биохимических и гематологических показателей крови карликовых свиней при трехкратной вакцинации.

4. Оценить иммуногенные свойства вакцины «Гам-VLP-рота» при ее трёхкратном введение новорожденным карликовым свиньям.

5. Оценить протективность вакцины «Гам-VLP-рота» при ее трёхкратном введение новорожденным карликовым свиньям.

Научная новизна работы. Впервые в нашей стране получен и охарактеризован препарат двуслойных вирусоподобных частиц, состоящих из рекомбинантных белков VP2 и VP6 ротавируса А человека. Впервые на его основе разработана иммуноферментная тест-система, предназначенная для оценки иммунного ответа у различных видов животных, отличающаяся высокими валидационными параметрами.

Научно обоснованы и экспериментально подтверждены подходы к выбору лабораторных моделей и методов исследований при конструировании и оценке эффективности вакцинных препаратов против ротавирусных инфекций человека и животных.

Доказано, что разработанная тест-система на основе ИФА может использоваться в качестве внутреннего и внешнего контроля при серийном производстве вакцины «Гам-VLP-рота».

В опыте на карликовых свиньях установлена высокая иммунобиологическая эффективность вакцины «Гам-VLP-рота» и показано, что трёхкратная иммунизация в дозах 30 и 120 мкг вызывает формирование противовирусного иммунитета у животных.

Показана хорошая переносимость вводимого препарата во всём диапазоне доз. Впервые показано, что трехкратная иммунизация вакциной «Гам-VLP-рота» в дозировках 30 мкг, 120 мкг и 600 мкг не вызывает неблагоприятных эффектов и не влияет на клинические и биохимические гематологические показатели крови подопытных животных.

Научная новизна работы и отдельных методических подходов подтверждены: Патентом РФ на изобретение «Вирусоподобные химерные

частицы для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого респираторного синдрома Sars-Cov-2, содержащие белки коронавируса и ротавируса» № RU 2779810 С1 [10] и Патентом РФ на изобретение «Иммунобиологическое средство на основе вирусоподобных частиц для индукции специфического иммунитета против инфекции, вызываемой ротавирусом А человека» № RU 2795055 [11], в которых нашли отражение результаты проведенных исследований.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в апробации современных подходов к конструированию рекомбинантных антигенов ротавирусов и научно-практическом обосновании использования подходов фармацевтической химии, а также иммунологических, биохимических и гематологических показателей в опытах по определению иммуногенности вакцины «Гам-УЬР-рота». Сформулировано предложение по использованию комплекса разноплановых лабораторных методов исследований, характеризующих гуморальный и клеточный иммунный ответ к ротавирусу А человека у мышей, морских свинок и карликовых свиней.

Практическая значимость работы состоит в том, что материалы диссертации вошли в нормативно-техническую документацию на государственную регистрацию и производство вакцины «Гам-УЬР-рота» «Вакцина для профилактики ротавирусной инфекции человека, вызванной ротавирусом типа А» и в отчет по доклиническим исследованиям вакцинного препарата. В настоящее время вакцина «Гам-УЬ?-рота» проходит 2/3 фазы клинического исследования на детях разных возрастов.

Методология и методы исследования. Для проведения исследования иммуногенности и безопасности вакцины на основе УЬ? для профилактики ротавирусной инфекции с использованием релевантной модели животных предусмотрен комплексный методический подход, включающий: разработку и валидацию методик контроля вакцинного препарата, подготовку животных к опытам; оценку базовых показателей, включая гематологический и биохимический анализ; планирование экспериментов; вакцинацию и контроль за

процессом; мониторинг иммунного ответа; исследование противовирусной защиты; статистическая обработка полученных данных для оценки степени иммуногенности вакцины и её эффективности в профилактике ротавирусной инфекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана и внедрена чувствительная и специфичная тест-система на основе иммуноферментного анализа для определения IgG и ^А антител к ротавирусу А на различных моделях животных.

2. Разработана и валидирована методика оценки показателя «специфическая активность» вакцины для использования при её выпуске в рамках нормативной документации.

3. Результаты безопасности, иммуногенности и протективности вакцины на модели новорожденных карликовых свиней позволят оценить ее перспективность для дальнейшего ее тестирования в клинических испытаниях.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 3.4.2 Фармацевтическая химия, фармакогнозия (фармацевтические науки) по следующим областям исследования:

1. Исследование и получение биологически активных веществ на основе направленного изменения структуры синтетического и природного происхождения и выявление связей и закономерностей между строением и свойствами веществ.

2. Формулирование и развитие принципов стандартизации и установление нормативов качества, обеспечивающих терапевтическую активность и безопасность лекарственных средств.

3. Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления.

Степень достоверности результатов. Достоверность полученных результатов обусловлена использованием достаточного объема фактического

материала, применением адекватных поставленным задачам методов исследования и использованием современных методов статистической обработки экспериментальных данных. Достоверность результатов была обеспечена статистической обработкой полученных результатов при уровне значимости <0,05. В работе в ходе валидации определена специфичность, повторяемость (не более 15 %) и промежуточная прецизионность (не более 15 %). В работе использованы стандартные положительные и отрицательные стандартные образцы предприятия. Проведено количественное моделирование с усвоением экспериментальных данных.

Апробация результатов диссертационной работы. Апробация работы была проведена на расширенном заседании лаборатории молекулярной диагностики в составе Испытательного Центра совместно с производителем лекарственных средств «Медгамал» филиалом ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (протокол №12 от 16.10.2025).

Основные результаты работы были представлены на Всероссийской научно -практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы профилактики инфекционных и неинфекционных болезней: эпидемиологические, организационные и гигиенические аспекты», 2022 г., на «Первом Российском конгрессе медицинской микробиологии», г. Москва, 2023 г., «У11 Съезде биофизиков России», г. Краснодар, 2023 г. [12] и на заседаниях ученого совета ФГБУ «НИЦЭМ им. Гамалеи» Минздрава России.

Личный вклад автора. Личный вклад автора заключался в организации и проведении экспериментов, анализе результатов, интерпретации данных, а также разработке и тестировании гипотез. Автор уделял особое внимание качеству проведенных исследований, обеспечивая выполнение всех этапов согласно установленным протоколам и стандартам. Кроме того, автор активно участвовал в критическом обсуждении полученных результатов с коллегами и научными руководителями, что способствовало выявлению новых перспектив и направлений для дальнейших исследований. Вклад автора также проявился в подготовке

научных публикаций, презентациях на конференциях. Суммарное личное участие автора в работе составляет не менее 80%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, списка используемой литературы, включающего 11 отечественных и 174 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована таблицами 29 и 15 рисунками.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 5 работ: 4 статьи в научных изданиях, рекомендуемых ВАК и индексируемых в международных базах цитирования (Scopus и CAS), 1 патент Российской Федерации.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах, индексируемых в международных базах Scopus и CAS:

1. Филатов, И. Е. Использование вирусоподобных частиц на основе рекомбинантных вирусных белков VP2/VP6 ротавируса А для оценки гуморального иммунного ответа методом ИФА / И. Е. Филатов, В. В. Цибезов, М. В. Баландина, С. Н. Норкина, О. Е. Латышев, О. В. Елисеева, С. А. Черепушкин, О. А. Верховский, Т.В. Гребенникова // Вопросы вирусологии. — 2023. — Т. 68. — № 2. — С. 161-171. DOI: 10.36233/0507-4088-169.

2. Костина, Л. В. Исследование безопасности и иммуногенности вакцины на основе VLP для профилактики ротавирусной инфекции на модели новорожденных карликовых свиней. / Л. В. Костина, И. Е. Филатов, О. В. Елисеева, О. Е. Латышев, Я. Ю. Чернорыж, К. И. Юрлов, Е. И. Леснова, К. М. Хаметова, С. А. Черепушкин, Т. Е. Савочкина, В. В. Цибезов, К. Л. Крышень, Л. И. Алексеева, Т. В. Гребенникова // Вопросы вирусологии. — 2023. — T. 68. — N. 5. — С. 415-428. DOI:10.36233/0507-4088-194

3. Филатов, И. Е. Определение специфической активности ротавирусной вакцины на основе вирусоподобных частиц с использованием иммуноферментного анализа: разработка и валидация методики / И. Е. Филатов,

М. М. Силаенкова, В. В. Цибезов, М. В. Баландина, С. Н. Норкина, О. Е. Латышев, О. В. Елисеева, С. А. Черепушкин, Т. В. Гребенникова// БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. — 2024. — T. 24. — N. 4. — С.435-448. DOI:10.30895/2221-996X-2024-24-4-389-402

4. Ledenev, O.V. Toxicity evaluation of a VLP-based vaccine against human rotavirus infection following a single administration in rats: serum biochemistry and histopathological examination of organs and injection site / O.V. Ledened, I. E. Filatov, O. V. Eliseeva, O. E. Latyshev, I. A. DyachenkoS, G. A. lashcheva, E. R. Shaykhutdinova, E. N. Kazakova, S. R. Sadovnikova, O. I. Patsap, V. V. Lebedeva, A. N. Murashev, T. V. Grebennikova // Journal of Drug Delivery and Therapeutics. — 2025. V.15. - N.8. — P. 69-79. DOI.ORG/10.22270/jddt.v15i8.7314

Патенты РФ:

5. Гребенникова, Т. В. Вакцина против ротавирусной инфекции человека на основе вирусоподобных частиц ротавируса: патент № 2829862 Рос. Федерация : МПК A61K 39/12 (2006.01) / Т. В. Гребенникова, О. В. Елисеева, Л. В. Костина, О. Е. Латышев, И. Е. Филатов, С. А. Черепушкин, В. В. Цибезов, О. Н. Зайкова, А. А. Плотников, В. В. Лебедева, М. А. Лосич, К. М. Хаметова, С. Н. Норкина, М. М. Силаенкова, К. А. Южакова, Н. Ю. Куликова, Л. М. Алимбарова, А. А. Лазаренко, Н. П. Банковская, Т. В. Крестьянова, З. Б. Иванова, А. Л. Гинцбург ; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России. — № 2024109876; заявл. 07.04.2024; опубл. 07.11.2024, Бюл. № 31. — 18 с.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристика ротавирусов

Ротавирусы — это РНК-содержащие вирусы, геном которых представлен сегментами двухцепочечной РНК, они относятся к семейству Reoviridae, роду Rotavirus, и принадлежат к числу наиболее значимых патогенов, вызывающих острую кишечную инфекцию у младенцев и детей раннего возраста. Наряду с этим, ротавирусы поражают широкий спектр животных и птиц, ротавирусная инфекеция является экономически значимой в животноводстве и птицеводстве, что придаёт ротавирусам не только медицинскую, но и ветеринарную значимость [13-16].

В настоящее время на основании анализа последовательности гена капсидного белка VP6 Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) выделяет 9 групп ротавирусов (Ротавирус A-I) [17]. Наибольшее эпидемиологическое значение для человека имеет Ротавирус A (РВА), который несет ответственность за преобладающее число госпитализаций и летальных исходов среди детей в возрасте до 5 лет с острой кишечной инфекцией, а в глобальном масштабе занимает третье место в списке причин детской смертности, уступая лишь пневмонии и малярии [7, 18].

Ротавирусы относятся к безоболочечным вирусам с икосаэдрической симметрией и трёхслойным капсидом. Ротавирусные вирионы имеют размер около 70-75 нм в диаметре. Вирион состоит из внешнего слоя (белки VP4 и VP7), промежуточного слоя (VP6) и внутреннего ядра (VP2), в котором находится вирусный геном, связанный с РНК-зависимой РНК-полимеразой VP1 и кэпирующим белком VP3 [13, 14]. Ротавирусы обладают устойчивостью к кислотной среде желудка и к действию ряда протеолитических ферментов, что позволяет им эффективно инфицировать энтероциты тонкого кишечника [19].

Геном ротавирусов представлен 11 сегментами двухцепочечной РНК (дцРНК), каждый из которых кодирует один или два белка. Геном кодирует 6

структурных белков (VP1-VP4, VP6, VP7) и шесть неструктурных белков (NSP1-NSP6) [20]. Как и у вируса гриппа, сегментированная организация генома обусловливает высокую вероятность генетической реассортации при коинфекции хозяина двумя или более ротавирусами, особенно относящимися к одной группе, что ведет к появлению новых генотипов с изменёнными биологическими свойствами и увеличивает вероятность межвидовых переходов ротавирусов, в том числе от животных к человеку [21, 17].

Классификация РВА осуществляется по серотипам, связанным с внешними капсидными белками VP7 (G-тип) и генотипам, определяемым по последовательности гена белка VP4 (P-тип), а также по принципу полногеномной типизации, так называемым genotype constellations: определенные комбинации всех 11 генов отражают их устойчивые сочетания, эволюционное происхождение и межвидовые адаптации РВА. Наиболее часто встречающиеся сочетания генов у РВА инфицирующих человека — Wa-группа, DS-1-группа и AU-1-группа [22, 23].

Ротавирусы обладают выраженным зоонозным потенциалом. Широкий круг инфицируемых видов, наличие общих генотипов у человека и животных, а также многочисленные задокументированные случаи межвидовой передачи и реассортации РВА, подчеркивают роль животных резервуаров в циркуляции вируса и его эволюции [24, 25]. Особенно важную роль в этом контексте играют поросята и телята, у которых нередко обнаруживаются штаммы РВА, генетически близкие к человеческим изолятам [26, 27].

Таким образом, ротавирусы представляют собой группу вирусов, хорошо адаптированных к инфицированию человека, животных и птицы, их генетическая пластичность, основанная на сегментированном строении генома, придает им способность к быстрой эволюции и изменчивости. Эти особенности ротавирусов ставят сложные задачи перед программами вакцинопрофилактики, требует постоянного мониторинга эпидемиологической обстановки и актуализации штаммового состава вакцин [28].

1.2 История открытия ротавирусов

Первые описания вирусов, вызывающих характерную острую кишечную инфекцию у детей и животных, которая сейчас прочно ассоциирована с ротавирусами, относятся к 1960-м годам, когда были обнаружены некультивируемые патогены у телят и поросят, вызывающие клинически выраженные формы гастроэнтерита, а медицинские вирусологи отмечали значительное количество случаев тяжелой диареи у детей, этиология которых оставалась неясной, хотя по клинической картине все указывало на острую инфекцию [29, 30].

Описание ротавирусов как новой, самостоятельной группы вирусов, произошло в 70-е годы, в результате развития электронно-микроскопических методов. В 1973 году австралийская исследователь Рут Бишоп с соавторами опубликовали работу, в которой впервые представили электронно -микроскопические (ЭМ) фотографии вирусных частиц в эпителии тонкого кишечника детей с острой кишечной инфекцией [31]. Частицы имели характерную форму: двойной капсид внешний слой которого сформирован шипиками, все вместе по виду напоминает «колёсико» (отсюда и название rota — лат. «колесо»). Эти структуры были обнаружены и в срезах тканей и в фекальных образцах, что явно указывало на обнаружение нового вируса, связанного с острыми гастроэнтеритами у детей.

После обнаружения ротавирусов у детей ветеринарные вирусологи посмотрели на проблему диарейных расстройств у телят и поросят, вирусная природа которой была уже хорошо известна, но вирусный агент оставался не классифицированым. В свете новых данных, достаточно быстро было установлено, что эти вирусы так же являются ротавирусами, что указывало на возможный зоонозный характер новой группы вирусов и универсальность их распространения среди млекопитающих [32].

На основании морфологических характеристик, устойчивости к эфиру, чувствительности к протеазам и особенностей вирусной РНК, новая группа вирусов была включена в состав семейства Reoviridae как род Rotavirus [32, 14].

В середине 1970-х годов идентификация ротавирусов осуществлялась по обнаружению характерных вирусных частиц в клиническом материале методом ЭМ. Метод был отработан и усовершенствован идентификации вирусных частиц в кале и стал своего рода золотым стандартом для диагностики ротавируса, однако ЭМ могла быть применена только в ограниченном числе лабораторий и для ограниченного числа образцов. Впоследствии были разработаны методы лабораторной диагностики, использующиеся и сегодня: ИФА и ПЦР [33-36].

Важнейшей особенностью ротавирусов является сегментированный геном, состоящий из 11 отдельных молекул дцРНК [37]. Эта особенность организации генома ротавирусов объясняет феномен быстрой изменчивости, сравнительную легкость с которой они совершают межвидовые переходы и возникновение новых сочетаний генотипов и серотипов [24].

С использованием гипериммунных сывороток в перекрестных реакциях нейтрализации были описаны серотипы РВА на основе двух основных антигенных белков — VP7 и VP4, которые определяют G- и P-тип вируса соответственно. В дальнейшем по нуклеотидной последовательности сегментов генома, кодирующих эти белки, были описаны соответствующие генотипы. Серотипы принято обозначать цифрами, генотипы — цифрами в квадратных скобках. Нумерация G генотипов и серотипов совпадает, P-генотипов и серотипов отличается [14, 38].

В дальнейшем эта классификация была дополнена генотипами, основанными на устойчивых сочетаниях определенных сегментов на уровне полного генома [22].

Идентификация этиологического агента ротавирусной инфекции дала возможность постепенно оценить глобальное бремя заболевания, в результате было установлено, что ротавирус входит в тройку основных причин детской смертности, особенно тяжелая картина наблюдается в странах с низким и средним

уровнем дохода [18, 39]. Эти данные сфокусировали внимание ученых на необходимости разработки и внедрения методов вакцинопрофилактики РВА, особенно в странах, где доступ к качественной медицинской помощи ограничен.

В конце 70-х - начале 1980-х были накоплены данные о наличии ротавирусов, не относящихся к группе А. Линда Сайф одна из первых обратила внимание на то, что антитела к VP6, реагирующие с большинством известных ротавирусов, не узнают некоторые штаммы [40, 41]. Были описаны группы ротавирусов B и C, которые реже встречаются у человека, но обладают эпидемиологической значимостью в отдельных популяциях и могут циркулировать среди животных [42, 43]. РВА, однако, был и остается самым значимым для человека ротавирусом. Группоспецифический антиген VP6 и сейчас используется как маркер принадлежности ротавируса к конкретной группе [44].

На рубеже 1970-1980-х в разных лабораториях велась интенсивная работа по адаптации ротавируса к культуре клеток, были накоплены первые данные по культивированию ротавирусов человека и животных в первичных и перевиваемых культурах клеток [45, 46]. Ключевым достижением стала работа Ward и соавторов (1984), в которой была описана методика эффективного наращивания вируса на перевиваемых линиях (MA-104) после адаптации на первичных клетках [47]. Эти исследования не только дали возможность выделять, исследовать и типировать полевые изоляты (штаммы) вируса, но, главное, открыли путь к разработке первого поколения ротавирусных вакцин на основе антигена вируса, выделенного в перевиваемой культуре клеток.

С точки зрения исторической перспективы, таким образом, открытие ротавирусов стало важнейшим событием в области исследований ОКИ детей. Стали понятны причины значительной доли случаев тяжёлой диареи у детей, особенно раннего возраста, появилась возможность создания средств профилактики, включая вакцины, которые стали применяться повсеместно с начала XXI века [7]. Важным оказался так же и ветеринарный аспект проблемы:

ротавирус остается экономически значимым патогеном в свиноводстве и для КРС, с высоким зоонозным потенциалом.

1.3 Эпидемиология и генотипическое разнообразие ротавирусов

Ротавирусы являются наиболее частой причиной ОКИ у детей младшего возраста во всём мире. На основании данных, собранных ВОЗ, до внедрения вакцин ежегодно регистрировалось около полумиллиона случаев смерти среди детей младше пяти лет, связанных с ротавирусной инфекцией. Показатели детской смертности сильно зависят от развития медицины и уровня жизни в стране, более чем на порядок различаются между собой наиболее развитые и самые бедные страны [7]. Так, например, на долю Индии в 2008 году приходилось 22% всех зарегистрированных смертей от ротавирусной инфекции [48]. По данным, опубликованным в 2003 году, медианные значения доли детской смертности от острой ротавирусной инфекции составили менее 1% в развитых странах и около 21 % в бедных странах [49].

Заболеваемость ротавирусной инфекцией имеет ярко выраженную сезонность в странах с умеренным климатом, пик заболеваемости в которых, как правило, приходится на холодное время года. В тропических регионах картина заболеваемости в течение года более сглаженная, хотя возможны локальные всплески ОКИ, связанные с сезонными изменениями влажности и санитарных условий [50, 51].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Филатов Илья Евгеньевич, 2025 год

- 0 |1 0

Иммунизация 1 Иммунизация 2 Иммунизация 3 Контроль Immunization 1 Immunization 2 Immunization 3 Control

Рисунок 9. Уровень специфических IgG-антител к белкам УР2/6 (А) и вируснейтрализующих антител (В) после трёхкратной иммунизации новорожденных карликовых свиней вакциной «Гам-УЪР-рота» (30 мкг/доза). Ось X - номер иммунизации, ось Y - среднее геометрическое значений обратных титров антител. Данные представлены с указанием значений доверительного интервала (95% ДИ). Различия между группой иммунизированных животных (иммунизация 2 и 3) и контролем (введение физиологического раствора) статистически значимы (р<0,05).

216000 4-

204000 - А

70006500- в

4800

192000 180000 168000 156000 144000 132000 120000 108000 96000 84000 72000 60000 48000 36000 24000 12000 0

105733

400

12800

600055005000 : 4500 : 4000350030002500200015001000 -

2600

500 - 0 0 -1-

Иммунизация 1 Иммунизация 2 Иммунизация 3 Контроль 1шшишгайоп 1 Гшшишгайоп 2 Ьпшшигайоп 3 СопЬ"о1

0

Иммунизация 1 Иммунизация 2 Иммунизация 3 Контроль Ьптипкайоп 1 1шшшшаЬоп 2 Ьшшшпайоп 3 СопНо!

Рисунок 10. Уровень специфических IgG-антител к белкам УР2/6 (А) и вируснейтрализующих антител (В) после трёхкратной иммунизации морских свинок вакциной «Гам-УЪР-рота» (30 мкг/доза). Ось X - номер иммунизации, ось Y - среднее геометрическое значений обратных титров антител. Данные представлены с указанием значений доверительного интервала (95% ДИ). Различия между группой иммунизированных животных (иммунизация 2 и 3) и контролем (введение физиологического раствора) статистически значимы (р<0,05).

Рисунок 11. Уровень специфических IgG-антител к белкам УР2/6 после трехкратной иммунизации мышей линии ВАЬВ/с вакциной «Гам-УЬР-рота» (30 мкг/доза) (А) и уровень IgG-антител в контрольной группе с введением физиологического раствора (В). Ось X - номер иммунизации, ось Y - среднее геометрическое значений обратных титров антител. Данные представлены с указанием значений доверительного интервала (95% ДИ). Различия между группой иммунизированных животных и контролем (введение физиологического раствора) статистически значимы (р<0,05).

В иммуноферментном анализе были зафиксированы исходные фоновые показатели оптической плотности сывороток мышей уже после первой иммунизации ^М = 10667) и отмечался дальнейший прирост фоновых значений в последующих иммунизациях ^М = 12533 - для 2 иммунизации и GM = 217600 - для 3 иммунизации), что не наблюдалось с сыворотками морских свинок и карликовых свиней.

Ранее проведенные исследования показали, что у мышей формируется значительный уровень защиты и нейтрализующий эффект в отношении ротавируса, которые не зависят от антител. Мыши имеют некоторую степень естественной защиты от вируса благодаря своим собственным антителам вследствие чего, их иммунная система адаптирована для борьбы с этим вирусом [173]. Так как получение в данном эксперименте достоверных данных об эффекте

исследуемой вакцины на мышах оказалось затруднительным, в связи с этим, было принято решение об отказе от дальнейшего их использования в качестве модельных животных.

Проведенные нами исследования подтвердили, что карликовые свиньи могут служить эффективным модельным объектом для определения качества вакцин против ротавирусной инфекции у людей. Однако это достаточно дорогостоящая модель для рутинных исследований. Было выявлено, что у морских свинок, которые получали плацебо, не наблюдалось фоновых значений, в то время как группа животных, иммунизированных вакциной, продемонстрировала выраженный иммунный ответ. Оценка иммуногенных свойств вакцины при трехкратной внутримышечной иммунизации животных показала образование высоких уровней специфических IgG и вируснейтрализующих антител. Сопоставление результатов ИФА и реакции нейтрализации, полученных после второй иммунизации, свидетельствуют о достаточном формировании иммунного ответа у животных. Таким образом, двукратная схема иммунизации позволит снизить нагрузку на иммунную систему при сохранении эффективности вакцинации.

Реакция нейтрализации является золотым стандартом для определения уровня вируснейтрализующих антител и широко применяется в вирусологической практике для серологической диагностики вирусных заболеваний. Однако метод является трудоемким и требует специальной подготовки персонала и квалификации помещений. ИФА, напротив, является более простым методом в исполнении, но наряду с этим обладает высокой чувствительностью и точностью, что позволяет выявлять специфические антитела даже при их минимальной концентрации.

Вследствие корреляции результатов ИФА с результатами вирусной нейтрализации валидацию методики определения специфической активности вакцины было решено проводить с использованием метода ИФА.

Валидация проводилась в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации XV изд. 0ФС.1.1.0012 [174] для экспериментального подтверждения пригодности метода непрямого ИФА для определения антител, специфических к ротавирусу А, в сыворотках крови иммунизированных морских свинок с целью контроля вакцинного препарата. Программа валидации включала исследование специфичности, повторяемости, внутрисерийной и межсерийной прецизионности.

Для подтверждения специфичности методики ИФА были подготовлены следующие образцы: в качестве положительного контрольного образца (К+) использовали поликлональную гипериммунную сыворотку морской свинки, в разведении 1:100 ФСБТ + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БР); в качестве отрицательных контрольных образцов (К-) использовали сыворотки не иммунных морских свинок, в разведениях от 1:100 до 1:12800 с шагом 2 в БР; в качестве модельных растворов №1-3 использовали гипериммунную сыворотку морской свинки, в разведениях от 1:100 до 1:12800 с шагом 2 в БР; в качестве контроля реагентов (КР) использовали БР.

Критерии приемлемости:

• среднее значение оптической плотности (А450) в лунках с фоном реакции (КР) не должно превышать 0,1, что также подтверждает отсутствие влияния компонентов БР на результаты реакции;

• среднее значение А450 в лунках с К- не более 0,2;

• А450 модельных растворов, содержащих антитела, специфичные к белкам УР2/6 ротавируса А, пропорциональна разведению модельных растворов. Результаты оценки специфичности метода представлены в таблице 6.

Значения А450

Разведение

Наименов ание образца 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800

Сыворотка крови не иммунизированного животного №1 0,136 0,105 0,079 0,068 0,055 0,048 0,046 0,046

Сыворотка крови не иммунизированного животного №2 0,129 0,101 0,074 0,066 0,053 0,049 0,046 0,045

Сыворотка крови не иммунизированного животного №3 0,135 0,106 0,077 0,065 0,055 0,048 0,046 0,046

Стандартное отклонение (SD) 0,004 0,003 0,003 0,002 0,001 0,001 0,000 0,001

Среднее значение К-по каждому разведению 0,133 0,104 0,077 0,066 0,054 0,048 0,046 0,046

Среднее значение К- 0,072

Коэффициент вариации (СУ, %) 2,8 2,5 3,3 2,3 2,1 1,2 0 1,3

Модельный раствор №1 0,643 0,539 0,480 0,462 0,407 0,392 0,302 0,243

Модельный раствор №2 0,618 0,546 0,506 0,470 0,396 0,396 0,294 0,246

Модельный раствор №3 0,684 0,627 0,534 0,508 0,427 0,349 0,333 0,267

Поликлональная гипериммунная сыворотка морской свинки (1:100) 0,697 0,695 - - - - - -

Контроль реагентов 0,049 0,046 - - - - - -

Полученные результаты подлежат учету, т.к. выполнены установленные критерии приемлемости:

• среднее значение А450 в лунках разведений (К-) = 0,072 (не более 0,2);

• среднее значение А450 в лунках (К+) = 0,697/0,695 (не менее 0,6);

• среднее значение А450 в лунках с КР = 0,049/ 0,046 (не должно превышать

0,1).

Подтверждено отсутствие влияния буферного раствора на результаты контроля.

Зависимость А450 модельных растворов от количественного содержания специфичных ротавирусу А антител представлена на рисунке 12.

0,3 0,7

100 200 400 300 1600 3200 6400 12300

Обратные значения тигра антител

Рисунок 12. Калибровочный график зависимости оптической плотности модельных растворов от количественного содержания специфических к ротавирусу А антител, построенный с использованием метода линейной регрессии. На графике представлены формулы регрессионного уравнения и значения R2 для каждого модельного раствора.

Таким образом, учитывая оптические плотности, полученные в результате титрования модельных растворов и сывороток, не вакцинированных морских свинок, было показано, что отсутствие аналитического сигнала от специфических сывороток, не вакцинированных животных, и наличие сигнала от модельных растворов может быть расценено как способность предложенной тест-системы селективно выявлять иммуноглобулины класса G к VP2/6 ротавируса А. Определены критерии работоспособности предложенной методики, при которых полученные результаты соответствуют критериям приемлемости, в частности, среднее значение А450 для образца К+ более 0,6; среднее значение А450 для

образцов К- менее 0,2; значение А450 контроля реагентов менее 0,1. Таким образом, методика непрямого ИФА обеспечивает высокую селективность определения специфических IgG-антител к ротавирусу А в образцах сыворотки крови морских свинок, иммунизированных вакциной.

Для оценки повторяемости результатов в качестве образцов были использованы сыворотки крови морских свинок, иммунизированных вакциной на основе УЪР для профилактики ротавирусной инфекции (30 мкг/доза), и сыворотки контрольных морских свинок (не иммунизированных).

Был произведен расчет среднего значения обратной величины титра IgG к УР 2/6 ротавируса А, стандартного отклонения (SD) и коэффициента вариации (СУ, %).

Критерий приемлемости. Коэффициент вариации (СУ, %) результатов, полученных в условиях повторяемости, не должен быть более 15%.

Результаты оценки повторяемости метода соответствуют критериям приемлемости и представлены в таблице 7.

Таблица 7. Результаты оценки повторяемости метода ИФА.

№ серии вакцины Обратная величина титра к УР2/6 ротавируса А (индивидуальные значения и среднее) Среднее значени е SD СУ, %

Измерение 1 Измерение 2 Измерение 3 Измерение 4

01 25600 22400 25600 28800 25600 25600 25600 22400 24800 3063,8 12,4

12800 12800 25600 12800

25600 51200 25600 25600

25600 25600 25600 25600

02 25600 25600 25600 22400 25600 25600 25600 22400 24000 1847,5 7,7

25600 12800 25600 12800

25600 25600 25600 25600

25600 25600 25600 25600

Значения коэффициента вариации как для 1 серии (12,4%), так и для 2 серии вакцины (7,7%) не превышали 15%, что говорит о повторяемости методики.

Для оценки промежуточной прецизионности метода проводили анализ тех же образцов сывороток морских свинок, что и при оценке повторяемости, на следующий день.

Критерий приемлемости. Для оценки точности методики сравнивали результаты исследований повторяемости и промежуточной прецизионности. Достоверность средних результатов (Р = 95 %) определяли по критерию ^ Стьюдента.

Табличное значение критерия Стьюдента (Ъабл) (Р = 95 %, f = п1 + п2 - 2 = 6)

= 2,45

Результаты оценки промежуточной прецизионности соответствуют критериям приемлемости и представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты оценки повторяемости метода ИФА (в условиях промежуточной прецизионности).

№ серии вакцин ы Обратная величина титра к УР2/6 ротавируса А (индивидуальные значения и среднее) Средне е SD СУ

Измерение 1 Измерение 2 Измерение 3 Измерение 4 значени е , %

25600 25600 25600 25600

01 25600 25600 12800 22400 12800 22400 12800 22400 23200 1600 6,9

25600 25600 25600 25600

25600 25600 25600 25600

25600 25600 25600 25600

02 25600 25600 12800 22400 25600 25600 12800 28800 25600 1600 10,2

25600 25600 25600 51200

25600 25600 25600 25600

Значения коэффициента вариации как для 1 серии (6,9%), так и для 2 серии вакцины (10,2%) не превышали 15%, что говорит о внутрилабораторной прецизионности метода.

Рассчитанное значение критерия Стъюдента ^рас = 0) менее табличного значения (1габл = 2,45), что свидетельствует об отсутствии существенных различий в воспроизводимости данных, полученных при исследовании повторяемости и промежуточной прецизионности метода.

Таким образом, в ходе валидационных испытаний и на основании полученных результатов установлено, что методика определения титра специфических иммуноглобулинов класса G к УР2/6 ротавируса А в сыворотках крови морских свинок, вакцинированных «Гам--УЬР--рота» (30 мкг/доза), методом иммуноферментного анализа удовлетворяет критериям приемлемости по тестам:

специфичность (соответствует критериям приемлемости), повторяемость (для 1 серии - 12,4%, 2 серии вакцины - 7,7%) и промежуточная прецизионность (для 1 серии - 6,9%, 2 серии вакцины - 10,2%), что гарантирует получение достоверных результатов анализа. Данная методика может использоваться для контроля показателя «специфическая активность» вакцины «Гам-УЬР-рота» для профилактики ротавирусной инфекции.

3.3 Исследование безопасности, иммуногенности и протективной активности вакцины «Гам-УЬР-рота» на модели карликовых свиней

Для оценки безопасности, иммуногенности и протективной активности вакцины «Гам-УЬР -рота» использовали модель новорожденных карликовых свиней, полученных от свиноматок, не имеющих специфических антител к ротавирусу А. Характеристика каждой группы представлена в таблице 9. Для оценки безопасности были изучены результаты всех групп животных, а для оценки иммуногенности и эффективности животные из групп №1, 2, 5.

Таблица 9. Характеристика экспериментальных групп.

Группа № Количеств о животных в группе Пол Препарат введения Объем дозы, мл Путь введения

1 7 в Вакцина «Гам-VLP-рота» 30 мкг/доза 0,5 Внутримышечно в наружную поверхность правого бедра, трехкратно

4 ?

2 5 в Вакцина «Гам-VLP-рота» 120 мкг/доза

5 ?

3 2 в Вакцина «Гам-VLP-рота» 600 мкг/доза

4 ?

4 1 в Буферный раствор для разведения УЪР с адъювантом (носитель)

8 ?

5 1 в Плацебо

Продолжение таблицы 9

2 ?

Обычно в клинических исследованиях используют две дозы антигена в 30 мкг и 120 мкг, дозировка 600 мкг антигена, используемая в данном эксперименте и в несколько раз превышающая терапевтические дозы, нужна для оценки возможных токсических эффектов вакцины.

3.3.1 Результаты исследования безопасности вакцины на модели

карликовых свиней

В рамках исследования безопасности вакцины «Гам-УЬР-рота» для профилактики ротавирусной инфекции была изучена динамика изменения массы, температуры тела животных. Так же были проанализированы основные гематологические и биохимические показатели крови подопытных карликовых свиней перед каждой иммунизацией и эвтаназией. Так же, в рамках изучения безопасности вакцины, было проведено исследование токсичности на модели крыс.

3.3.1.1 Динамика изменения массы тела поросят

Динамика изменения массы тела подопытных карликовых свиней представлена на рисунке 13.

Рисунок 13. График изменения массы тела поросят в течение периода иммунизации.

На рисунке 13 видно, что в течение всего эксперимента наблюдался положительный прирост массы тела животных в экспериментальных группах, что коррелирует с динамикой изменения массы тела у контрольной группы.

3.3.1.2 Динамика изменения температуры тела поросят

Динамика изменения температуры тела подопытных поросят представлена на рисунке 14.

Рисунок 14. График изменения ректальной температуры тела поросят в течение периода иммунизации.

На рисунке 14 видно, что в течение исследования у опытных групп животных наблюдались физиологические колебания температуры тела. Аналогичная картина наблюдалась у подопытных, получавших контрольное вещество и физиологический раствор, что свидетельствует о нормальной общей переносимости вводимого препарата во всём диапазоне доз.

3.3.1.3 Результаты гематологического анализа крови поросят

Анализ образцов цельной крови подопытных животных перед каждой иммунизацией и эвтаназией исследовали на гематологическом анализаторе Mythic 18 Vet (Orphee, Швейцария). Результаты анализа представлены в таблицах 10 - 13.

Группа, объект исследования, доза

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Буферный

Исследуемые показатели Вакцина 30 мкг/доза Вакцина 120 мкг/доза Вакцина 600 мкг/доза раствор для разведения VLP c адъювантом (носитель) Плацебо

n=11 n=10 n=6 n=9 n=8

RBC

Эритроциты, 1012/л 4,6±0,2 4,8±0,2 4,7±0,1 4,9±0,3 5,0±0,2

HGB

Гемоглобин, 82,9±4,0 87,1±3,9 86,3±4,0 87,8±3,7 90,3±4,3

г/л

HCT

Гематокрит, % 25,6±1,3 26,3±1,3 25,6±1,2 27,3±1,2 27,2±1,4

PLT

Тромбоциты, 109/л 511,2±69,58 287,9±56,25 289,7±23,6 444,3±41,6 329,4±39,9

WBC

Лейкоциты, 18,4±1,6 19,2±3,3 17,9±2,0 19,1±1,7 17,0±1,7

109/л

LYM

Лимфоциты, % 78,9±1,8 77,2±2,4 67,8±5,4 72,5±3,7 73,0±2,6

MON

Моноциты, 2,0±0,1 2,5±0,2 2,6±0,2 2,4±0,2 2,5±0,1

%

GRA

Гранулоциты, % 19,1±1,8 20,3±2,3 29,6±5,1 25,1±3,6 24,5±2,5

иммунизацией.

Исследуемые показатели Группа, объект исследования, доза

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Вакцина 30 мкг/доза Вакцина 120 мкг/доза Вакцина 600 мкг/доза Буферный раствор для разведения VLP c адъювантом (носитель) Плацебо

n=11 n=10 n=6 n=9 n=8

RBC Эритроциты, 1012/л 4,8±0,4 4,8±0,4 5,1±0,2 5,5±0,3 4,5±0,4

HGB Гемоглобин, г/л 78,9±9,1 78,4±7,9 86,8±4,4 91,2±6,0 71,6±6,2

HCT Гематокрит, % 23,4±2,8 23,4±2,7 26,5±1,5 27,2±1,9 20,7±2,3

PLT Тромбоциты, 109/л 535,7±114,3 477,2±94,7 308,2±70,3 412±78,3 605,6±88,5

WBC Лейкоциты, 109/л 12,3±0,9 9,6±0,8 8,5±1,3 11,7±1,4 12,4±1,6

LYM Лимфоциты, % 80,1±1,4 78,7±2,0 74,2±2,3 74,7±2,9 81±2,25

MON Моноциты, % 2,3±0,1 2,1±0,1 4,2±1,01 2,5±0,1 1,9±0,1

GRA Гранулоциты, % 17,6±1,3 19,2±2,0 21,6±1,7 22,8±2,8 17,1±2,1

иммунизацией.

Группа, объект исследования, доза

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Буферный

Исследуемые показатели Вакцина 30 мкг/доза Вакцина 120 мкг/доза Вакцина 600 мкг/доза раствор для разведения VLP c адъювантом (носитель) Плацебо

n=11 n=10 n=6 n=9 n=8

RBC

Эритроциты, 1012/л 5,5±0,6 4,6±0,4 5,2±0,2 6,4±0,5 4±0,32

HGB

Гемоглобин, 78,8±10,0 69,6±7,5 76±2,8 95,9±8,0 60±4,9

г/л

HCT

Гематокрит, %С 23,6±3,0 19,9±2,2 22,7±0,8 28,4±2,5 16,7±1,3

PLT

Тромбоциты, 109/л 662,6±115,6 703,3±127,1 610,3±113,2 445,7±118,9 856,6±95,7

WBC

Лейкоциты, 109/л 13,3±0,6 12±0,6 10,4±1,3 17,5±4,2 14,5±1,8

LYM

Лимфоциты, 79,1±2,9 84,2±2,6 80,3±1,7 78,1±3,0 83,9±1,7

%

MON

Моноциты, 2,3±0,18 2±0,32 3±0,6 2,4±0,2 2±0,1

%

GRA

Гранулоциты, 18,6±2,9 13,8±2,3 16,7±1,3 19,5±3,0 14,2±1,8

%

эвтаназией.

Группа, объект исследования, доза

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Буферный

Исследуемые показатели Вакцина 30 мкг/доза Вакцина 120 мкг/доза Вакцина 600 мкг/доза раствор для разведения VLP c адъювантом (носитель) Плацебо

n=11 n=10 n=6 n=9 n=8

RBC Эритроциты, 1012/л 6,5±0,6 5,5±0,5 5,9±0,6 7±0,6 5,2±0,4

HGB Гемоглобин, г/л 89,6±8,7 80,8±7,7 84,3±7,3 99,7±8,8 76,6±5,0

HCT Гематокрит, % 26,8±2,4 23,5±2,4 24,1±2,2 29,7±2,7 21,6±1,6

PLT Тромбоциты, 109/л 601,3±56,1 666,8±148,5 785,7±56,6 596,3±91,7 817,7±117,5

WBC Лейкоциты, 109/л 12,7±1,3 9,6±0,9 10,6±0,6 13,4±1,4 11,2±1,2

LYM Лимфоциты, % 78,8±2,1 80,7±1,9 80,9±1,6 75±2,8 81,1±2,7

MON Моноциты, % 2,3±0,1 2,4±0,1 2,3±0,1 2,6±0,1 2,9±0,3

GRA Гранулоциты, % 18,9±2,1 17±1,8 16,8±1,6 22,4±2,7 16±2,6

При анализе образцов крови, отобранных перед 1 -й иммунизацией, однофакторный дисперсионный анализ данных не выявил влияние фактора «группа» на исследуемые показатели ф>0,05).

При анализе образцов крови, отобранных перед 2 -й иммунизацией, однофакторный дисперсионный анализ данных выявил влияние фактора «группа»

на показатель «моноциты» (MON) (p<0,05). Последующий анализ при помощи критерия Тьюки выявил статистически значимое повышение данного показателя у животных, получавших тестируемый объект в дозе 600 мкг относительно животных, получавших 0,9% натрия хлорид и буферный раствор для разведения VLP c адъювантом.

Статистический анализ остальных показателей не выявил влияния фактора «группа» (p>0,05, one-way ANOVA). С учетом отсутствия изменений по остальным показателям, в том числе процентному соотношению гранулоцитов и лимфоцитов, выявленные изменения целесообразно считать клинически не значимыми.

При анализе образцов крови, отобранных перед 3-й иммунизацией, однофакторный дисперсионный анализ данных выявил влияние фактора «группа» на показатели «эритроциты» (RBC), «гемоглобин» (HGB) и «гематокрит» (HCT) (p<0,05). Последующий анализ при помощи критерия Тьюки выявил статистически значимое повышение данных показателей у животных, иммунизированных буферным раствором для разведения VLP c адъювантом, относительно животных, получавших 0,9% натрия хлорид. Анализ остальных показателей не выявил влияния фактора «группа».

Выявленные изменения можно считать клинически незначимыми, ввиду отсутствия отличий по данным показателям у животных, получавших тестируемые объекты во всем диапазоне доз, относительно животных, иммунизированных буферным раствором для разведения VLP c адъювантом и 0,9% натрия хлоридом.

При анализе образцов крови, отобранных перед эвтаназией, однофакторный дисперсионный анализ данных не выявил влияние фактора «группа» на исследуемые показатели (p>0,05).

Можно сделать общий вывод о том, что трехкратная иммунизация вакциной «Гам-VLP-рота» в дозировках 30 мкг, 120 мкг и 600 мкг не вызывает неблагоприятных эффектов на гематологические показатели крови подопытных животных.

Анализ образцов сыворотки крови подопытных животных перед каждой иммунизацией и эвтаназией исследовали на биохимическом анализаторе «Random Access А-25» (Biosystem, Испания). Результаты анализа представлены в таблицах 14-17.

Группа, объект исследования, доза

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Буферный

Исследуемые показатели Вакцина 30 мкг/доза Вакцина 120 мкг/доза Вакцина 600 мкг/доза раствор для разведения VLP c адъювантом (носитель) Плацебо

n=11 n=10 n=6 n=9 n=8

Глюкоза, ммоль/л 7,4±0,2 8±0,3 9,6±0,8 8,2±0,3 7,6±0,3

Общий холестерин, ммоль/л 3±0,2 3±0,4 5,6±1,4 5,1±1,0 4,3±1,0

Триглицериды, ммоль/л 1,4±0,1 1,8±0,3 1,5±0,3 1,5±0,1 1,5±0,2

Мочевина, ммоль/л 3,1±0,3 3,5±0,4 3,3±0,4 3,5±0,8 6,3±1,3

Общий билирубин, мкмоль/л 5,5±0,6 5,7±0,8 3,7±0,7 5,7±0,6 4,2±0,8

Креатинин, мкмоль/л 92,6±4,9 87,9±5,9 76±10,4 94,8±3,3 72,7±4,4

Общий белок, г/л 65,2±2,9 66±2,9 62,9±2,8 63,7±2,7 63,3±3,0

Альбумин (А), г/л 26,4±1,5 26±1,4 35,6±5,2 27,8±3,7 24,6±1,2

Глобулин (G), г/л 38,9±2,5 40±3,4 27,3±5,1 35,9±3,8 38,8±3,0

Отношение A/G 0,7±0,1 0,7±0,1 1,9±0,7 1±0,3 0,7±0,1

Аланинаминотран сфераза, Ед/л 44,2±3,1 37±3,2 41,7±5,6 49,4±6,1 42,6±1,5

Аспартатаминотра нсфераза, Ед/л 55,6±9,1 51,1±6,2 49±10,5 74,1± 18,9 45,9±3,4

Щелочная фосфатаза, Ед/л 1929,4± 120,0 1812,9± 134,0 1662,7± 370,3 1505,8± 181,5 1739± 124,6

Исследуемые показатели Группа, объект исследования, доза

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Вакцина 30 мкг/доза Вакцина 120 мкг/доза Вакцина 600 мкг/доза Буферный раствор для разведения VLP c адъювантом (носитель) Плацебо

n=10 n=10 n=6 n=9 n=8

Глюкоза, ммоль/л 8,6±0,4 7,3±0,21 8,9±0,5 8,5±0,33 9,2±0,9

Общий холестерин, ммоль/л 5,2±0,7 5,3±0,7 6,4±0,6 6,3±0,61 5,8±0,8

Триглицериды, ммоль/л 1,1±0,1 0,9±0,1 1,7±0,2 1,2±0,1 1,6±0,3

Мочевина, ммоль/л 2,7±0,4 2,7±0,3 4±0,4 2,3±0,3 2,7±0,3

Общий билирубин, мкмоль/л 3,5±0,4 3,3±0,3 3,8±0,9 3,5±0,5 2,5±0,5

Креатинин, мкмоль/л 94,7±5,5 86,1±3,7 82,8±9,0 95,2±6,0 90,9±7,4

Общий белок, г/л 63,8±2,0 58,3±1,1 62,8±3,4 62,1±2,0 60±4,8

Альбумин (А), г/л 36,6±1,6 34,7±1,2 40,2±1,6 34,3±1,3 37,6±1,1

Глобулин (G), г/л 27,2±1,3 23,6±1,44 22,6±2,7 4 27,8±1,85 27±2,63

Отношение A/G 1,4±0,1 1,5±0,1 1,9±0,2 1,3±0,1 1,5±0,2

Аланинаминотрансф ераза, Ед/л 34,8±2,6 31,2±3,3 31,7±3,6 37,1±3,9 28,8±2,4

Аспартатаминотранс фераза, Ед/л 50,3±5,9 39,7±4,6 57,7±10, 35 52,4±9,45 32,7±4,2 8

Щелочная фосфатаза, Ед/л 1575,7± 136,9 1403,1± 125,6 1416,5± 188,4 1772,6± 254,8 1476,3± 123,4

иммунизацией.

Группа, объект исследования, доза

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Исследуемые показатели Вакцина 30 мкг/доза Вакцина 120 мкг/доза Вакцина 600 мкг/доза Буферны й раствор для разведен ия VLP c адъювант ом (носитель ) Плацебо

n=10 n=10 n=6 n=9 n=8

Глюкоза, ммоль/л 7,8±0,3 9,6±0,9 8,4±0,5 8,4±1,0 9,8±1,4

Общий холестерин, ммоль/л 6,7±0,8 6,8±1,0 5,9±0,9 8,9±1,2 7,3±1,2

Триглицериды, ммоль/л 1,1±0,1 1,2±0,1 0,5±0,1 1,6±0,4 1,2±0,2

Мочевина, ммоль/л 2,4±0,3 2,8±0,2 1,8±0,3 2,7±0,4 4,5±1,8

Общий билирубин, мкмоль/л 3,5±0,7 2,6±0,4 2±0,3 4,4±1,2 3,9±0,5

Креатинин, мкмоль/л 96±9,4 98,4±3,6 85,6±2,9 115,3±6,0 100,4±4, 6

Общий белок, г/л 64,5±1,2 62±1,9 56,1±2,0 66,1±2,9 63,1±1,9

Альбумин (А), г/л 40,6±1,0 38,9±1,7 41,4±0,7 39,6±1,3 41,8±1,8 4

Глобулин (G), г/л 23,9±0,8 23,1±1,2 14,7±1,9 26,5±2,1 21,3±1,8

Отношение A/G 1,7±0,1 1,7±0,1 3,1±0,4 1,6±0,1 2,2±0,41

Аланинаминотрансфераз а, Ед/л 35,6±3,9 27,9±1,2 27,5±2,6 30,6±3,5 26,4±3,4

Аспартатаминотрансфер аза, Ед/л 55,5±12,5 29±2,8 35±4,5 50±7 43,5± 11,2

Щелочная фосфатаза, Ед/л 908,3± 71,8 879,4± 63,7 929,7± 123,8 1166,1± 232,7 777,3± 54,2

Исследуемые показатели Группа, объект исследования, доза

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Вакцина 30 мкг/доза Вакцина 120 мкг/доза Вакцина 600 мкг/доза Буферны й раствор для разведен ия VLP c адъювант ом (носитель ) Плацебо

n=10 n=9 n=6 n=9 n=7

Глюкоза, ммоль/л 7,3±0,6 6,2±0,3 7,2±0,3 7,7±0,9 6,4±0,5

Общий холестерин, ммоль/л 6,2±0,7 5,6±0,9 4,5±0,5 8±0,9 5,1±1,1

Триглицериды, ммоль/л 0,8±0,2 0,8±0,2 0,7±0,1 0,7±0,2 1,1±0,3

Мочевина, ммоль/л 3,9±0,7 3,9±1,1 2,4±0,4 3,7±0,7 3,9±0,8

Общий билирубин, мкмоль/л 3,2±0,9 3,8±1,2 2,1±0,4 2,7±0,5 3±0,7

Креатинин, мкмоль/л 85,7±4,7 73,8±3,7 95,5±10,7 90,5±5,5 85,7±5,2

Общий белок, г/л 64±1,3 60,6±1,4 57,3±1,6 61,6±1,6 62,1±1,7

Альбумин (А), г/л 43,3±1,3 42±1,1 43,2±0,9 41,6±1, 44,1±1,3

Глобулин (G), г/л 20,7±1,0 18,7±1,7 14,2±1,9 20±0,8 18±1,7

Отношение A/G 2,1±0,1 2,5±0,3 3,3±0,5 2,1±0,2 2,7±0,5

Аланинаминотрансфераз а, Ед/л 31,4±3,3 29,9±3,9 27,7±3,1 33,4±5,0 33,3±7,6

Аспартатаминотрансфер аза, Ед/л 41,1±5,3 31,6±5,4 42,5±5,4 53,5±6,0 41,4±7,7

Щелочная фосфатаза, Ед/л 612,9±50,0 649±68,0 693±105,2 678,3± 64,4 548± 64,1

При анализе образцов крови, отобранных перед 1 -й иммунизацией, однофакторный дисперсионный анализ данных выявил влияние фактора «группа» на показатели «мочевина» (BUN), «отношение А/Г» (A/G), глюкоза (GLU) и «креатинин» (CREA) (p<0,05). Последующий анализ при помощи критерия Тьюки

выявил снижение показателя «мочевина» у животных, получавших тестируемый объект в дозе 30 мкг, относительно животных, получавших 0,9% натрия хлорид, повышение показателя «отношение А/Г» у животных, получавших тестируемый объект в дозе 600 мкг, относительно животных, получавших 0,9% натрия хлорид, повышение показателя «Глюкоза» у животных, получавших тестируемый объект в дозе 600 мкг, относительно животных, получавших 0,9% натрия хлорид. Анализ остальных показателей не выявил влияния фактора «группа».

При анализе образцов крови, отобранных перед 2 -й иммунизацией, однофакторный дисперсионный анализ данных выявил влияние фактора «группа» на показатели «триглицериды» (TG) и «мочевина» (BUN) (p<0,05). Последующий анализ при помощи критерия Тьюки выявил статистически значимое повышение показателя «мочевина» у животных, получавших тестируемый препарат в дозе 600 мкг относительно животных, получавших буферный раствор для разведения VLP c адъювантом. Выявленное изменение можно считать клинически незначимыми, ввиду отсутствия отличий по данному показателю относительно животных, получавших 0,9% натрия хлорид. Анализ остальных показателей не выявил влияния фактора «группа» (p>0,05).

При анализе образцов крови, отобранных перед 3 -й иммунизацией, однофакторный дисперсионный анализ данных выявил влияние фактора «группа» на показатели «общий белок» (TP), «глобулины» (GLOB), «триглицериды» (TG) и «отношение А/Г» (A/G) (p<0,05). Последующий анализ при помощи критерия Тьюки выявил снижение показателя «триглицериды» у животных, получавших тестируемый объект в дозе 600 мкг, относительно животных, получавших буферным раствор для разведения VLP c адъювантом, снижение показателя «общий белок» у животных, получавших тестируемый объект в дозе 600 мкг, относительно животных, получавших буферный раствор для разведения VLP c адъювантом, снижение показателя «глобулины» у животных, получавших тестируемый объект в дозе 600 мкг, относительно животных, получавших буферным раствор для разведения VLP c адъювантом, повышение показателя «отношение А/Г» у животных, получавших тестируемый объект в дозе 600 мкг,

относительно животных, получавших буферным раствор для разведения VLP c адъювантом. Выявленные изменения можно считать клинически незначимыми, ввиду отсутствия отличий по данному показателю относительно животных, получавших 0,9% Натрия хлорид. Анализ остальных показателей не выявил влияния фактора «группа» (p>0,05).

При анализе крови перед эвтаназией, однофакторный дисперсионный анализ данных самцов и самок выявил влияние фактора «группа» на показатели «глобулины» (GLOB) (p<0,05). Последующий анализ при помощи критерия Тьюки не выявил статистически значимых отличий от контрольной группы.

Можно сделать общий вывод о том, что трехкратная иммунизация вакциной «Гам-VLP-рота» в дозировках 30 мкг, 120 мкг и 600 мкг не вызывает неблагоприятных эффектов на гематологические показатели крови подопытных животных.

3.3.2 Результаты исследования острой токсичности на модели крыс SD

Для оценки токсичности препарата были исследованы биохимические показатели сывороток крови крыс, после однократной внутримышечной иммунизации. Целью расширенного токсикологического исследования является подтверждение безопасности применения данной вакцины на крысах SD при однократном введении. Данное исследование направлено на выявление возможных побочных эффектов при однократном внутримышечном введении тестируемого объекта в трех дозах в остром периоде (в течение 24 часов после введения), а также спустя две недели после введения для выявления отсроченных токсических признаков в периоде восстановления. Рисунок 15 демонстрирует выборку грызунов, а также распределение их по группам в соответствии исследуемой дозировки вакцины.

Рисунок 15. Распределение грызунов по группам в соответствии с исследуемой дозировкой вакцины.

Введение тестируемого объекта и носителя проводили внутримышечно в четырехглавую мышцу бедра в объеме 0,2 мл/животное (по 0,1 мл в обе задние лапы.

Группы Носитель Вакцина «Гам-УЬР-рота»

Плацебо 30 мкг/доза 120 мкг/доза 600 мкг/доза

День 2 Ыеап±8В, N=8 Mean±SD, N=8 Mean±SD, N=8 Meaп±SD, N=8

Глюкоза, ммоль/л 7,2 ± 0,3 6,5 ± 1,0 6,6 ± 0,5 6,4 ± 0,6

Мочевина, ммоль/л 6,9 ± 1,3 7,3 ± 1,0 7,0 ± 1,1 6,7 ± 0,9

Холестерин, ммоль/л 2,58 ± 0,15 2,44 ± 0,25 2,52 ± 0,18 2,80 ± 0,18 #

Триглицериды, ммоль/л 0,59 ± 0,13 0,54 ± 0,12 0,65 ± 0,11 0,58 ± 0,21

АЛТ, Ед/л 58 ± 5 56 ± 6 52 ± 5 49 ± 5 *

АСТ, Ед/л 102 ± 9 106 ± 13 101 ± 19 90 ± 14

Общий билирубин, мкмоль/л 3,9 ± 0,9 5,0 ± 0,8 3,7 ± 1,1 4,6 ± 0,9

Креатинин, мкмоль/л 49 ± 8 48 ± 3 50 ± 4 49 ± 3

ЩФ, Ед/л 820 ± 90 819± 138 792 ± 71 643 ± 86 *#

Альбумин, г/л 31,5 ± 0,8 32,2 ± 1,6 32,0 ± 1,6 32,4 ± 0,6

Кальций, ммоль/л 2,69 ± 0,09 2,72 ± 0,16 2,77 ± 0,14 2,75 ± 0,07

Неорганические фосфаты, ммоль/л 3,32 ± 0,26 3,36 ± 0,39 3,68 ± 0,21 3,49 ± 0,17

№+, ммоль/л 142,2 ± 1,4 141,6 ± 1,1 141,2 ± 1,1 140,8 ± 1,0

К+, ммоль/л 4,58 ± 0,25 5,15 ± 0,74 5,73 ± 0,96 * 4,93 ± 0,28

СГ, ммоль/л 100,9 ± 1,1 100,9 ± 0,9 100,8 ± 1,1 99,6 ± 1,0

Общий белок, г/л 51,4 ± 1,5 52,9 ± 3,6 53,6 ± 3,6 56,6 ± 2,1 *

Глобулины, г/л 20,0 ± 0,8 20,7 ± 2,2 21,6 ± 2,0 24,2 ± 1,6 *#

Альбумин/Глобулины 1,6 ± 0,0 1,6 ± 0,1 1,5 ± 0,1 1,3 ± 0,1 *#

Mean - среднее значение; SD - стандартная ошибка среднего; N - количество вариант в группе. АЛТ - аланин- аминотрансфераза; АСТ - аспартат-аминотрансфераза; ЩФ - щелочная фосфатаза;*- P<0,05 относительно группы 1; # - P<0,05 относительно группы 2, тест Kruskal-Wallis.

Как видно из таблицы 18 у самцов крыс основная часть выявленных статистически достоверных отличий между группами приходится на группу с максимальной дозой тестируемого объекта. Так в этой группе было обнаружено достоверное уменьшение уровней АЛТ (относительно контроля) и щелочной фосфатазы (относительно групп № 1 и 2). Также только в группе с максимальной дозой было обнаружено достоверное увеличение общего белка (относительно контроля), уровня глобулинов (относительно групп № 1 и 2) и соответственное уменьшение соотношения альбумин/глобулины (относительно групп № 1 и 2). Из межгрупповых отличий следует отметить увеличение уровня общего холестерина в группе № 4 относительно группы № 2. Скорее всего, достоверность этого отличия является результатом разнонаправленных тенденций в группах № 2 и 4 относительно контроля. Также в группе № 3 наблюдалось достоверное увеличение уровня ионов калия по сравнению с группой носителя, однако зависимости от дозы не наблюдалось, и данное изменение, вероятно, носит флуктуационный характер. После 2-недельного периода отмены достоверных отличий между группами самцов выявлено не было (Таблица 19).

Группы Носитель Вакцина «Гам-УЬР-рота»

Плацебо 30 мкг/доза 120 мкг/доза 600 мкг/доза

День 15 Ыеап±8В, N=6 Meaп±SD, N=6 Mean±SD, N=6 Meaп±SD, N=6

Глюкоза, ммоль/л 5,1 ± 0,5 5,0 ± 0,3 4,9 ± 0,4 4,9 ± 0,4

Мочевина, ммоль/л 8,1 ± 1,3 8,6 ± 0,8 8,0 ± 0,9 8,1 ± 1,9

Холестерин, ммоль/л 2,02 ± 0,26 2,20 ± 0,31 1,98 ± 0,25 2,39 ± 0,39

Триглицериды, ммоль/л 0,61 ± 0,17 0,62 ± 0,10 0,68 ± 0,26 0,71 ± 0,26

АЛТ, Ед/л 54 ± 11 53 ± 8 50 ± 7 59 ± 7

АСТ, Ед/л 100 ± 7 104 ± 7 97 ± 10 99 ± 5

Общий билирубин, мкмоль/л 3,7 ± 0,5 3,0 ± 0,9 3,3 ± 0,4 3,6 ± 0,5

Креатинин, мкмоль/л 48 ± 4 48 ± 2 49 ± 2 49 ± 1

ЩФ, Ед/л 613 ± 143 590 ± 87 540 ± 66 563 ± 82

Альбумин, г/л 33,9 ± 0,7 33,3 ± 0,6 34,2 ± 2,0 33,4 ± 0,9

Кальций, ммоль/л 2,66 ± 0,07 2,61 ± 0,11 2,68 ± 0,13 2,67 ± 0,06

Неорганические фосфаты, ммоль/л 3,20 ± 0,20 3,16 ± 0,20 3,21 ± 0,38 3,02 ± 0,14

№+, ммоль/л 141,8 ± 0,8 141,1 ± 0,8 140,7 ± 1,3 140,4 ± 2,0

К+, ммоль/л 4,65 ± 0,27 4,57 ± 0,17 5,06 ± 0,78 4,68 ± 0,22

СГ, ммоль/л 101,0 ± 0,6 100,4 ± 0,7 100,7 ± 1,3 100,0 ± 1,9

Общий белок, г/л 55,5 ± 1,2 55,0 ± 1,2 56,3 ± 3,5 56,0 ± 1,4

Глобулины, г/л 21,6 ± 1,0 21,7 ± 0,7 22,1 ± 1,6 22,6 ± 0,8

Альбумин/Глобулины 1,6 ± 0,1 1,5 ± 0,0 1,6 ± 0,1 1,5 ± 0,1

Mean-среднее значение; SD-стандартная ошибка среднего; N-количество вариант в группе. АЛТ - аланин- аминотрансфераза; АСТ - аспартат-аминотрансфераза; ЩФ - щелочная фосфатаза.

У самок через сутки после введения тестируемого объекта в группе с максимальной дозой наблюдалось достоверное увеличение уровней кальция (Таблица 20), общего белка и глобулинов относительно контроля и уменьшение соотношения альбумин/глобулины относительно групп № 1 и 3. Кроме того в группе № 3 было выявлено достоверно снижение уровня триглицеридов относительно группы № 2 вследствие разнонаправленности тенденций в группах № 2 и 3 относительно контроля. Также в группе № 3 был понижен уровень АСТ по сравнению с контролем, что, скорее всего, является флуктуацией из-за отсутствия связи зависимости от дозы тестируемой вакцины. После периода отмены достоверных изменений в изученных параметрах между группами самок выявлено не было (Таблица 21).

Группы Носитель Вакцина «Гам-УЬР-рота»

Плацебо 30 мкг/доза 120 мкг/доза 600 мкг/доза

День 2 Mean±SD, N=8 Meaп±SD, N=8 Mean±SD, N=8 Mean±SD, N=8

Глюкоза, ммоль/л 6,1 ± 0,5 5,8 ± 0,3 6,2 ± 0,5 5,5 ± 0,6

Мочевина, ммоль/л 7,1 ± 0,8 7,4 ± 0,6 6,9 ± 0,6 7,1 ± 1,2

Холестерин, ммоль/л 2,31 ± 0,34 2,40 ± 0,25 2,24 ± 0,22 2,29 ± 0,22

Триглицериды, ммоль/л 0,63 ± 0,09 0,72 ± 0,16 0,54 ± 0,10 # 0,61 ± 0,07

АЛТ, Ед/л 48 ± 5 46 ± 7 44 ± 3 42 ± 7

АСТ, Ед/л 118 ± 13 116 ± 11 99 ± 10 * 116 ± 21

Общий билирубин, мкмоль/л 3,5 ± 1,2 3,6 ± 0,8 4,0 ± 0,9 3,5 ± 1,2

Креатинин, мкмоль/л 53 ± 5 51 ± 2 54 ± 4 51 ± 5

ЩФ, Ед/л 440 ± 47 473 ± 60 446 ± 45 431 ± 49

Альбумин, г/л 33,2 ± 0,9 34,0 ± 0,5 33,4 ± 1,2 33,8 ± 1,4

Кальций, ммоль/л 2,62 ± 0,04 2,68 ± 0,06 2,66 ± 0,08 2,76 ± 0,10 *

Неорганические фосфаты, ммоль/л 3,10 ± 0,26 3,02 ± 0,30 3,10 ± 0,19 3,18 ± 0,38

№+, ммоль/л 141,5 ± 1,1 141,6 ± 1,1 141,4 ± 1,3 141,1 ± 1,1

К+, ммоль/л 4,62 ± 0,33 4,58 ± 0,24 4,59 ± 0,35 4,96 ± 0,76

СГ, ммоль/л 101,0 ± 0,7 101,2 ± 0,8 101,0 ± 1,2 100,8 ± 1,1

Общий белок, г/л 54,1 ± 1,7 56,1 ± 1,2 54,7 ± 2,2 57,3 ± 2,6 *

Глобулины, г/л 20,9 ± 0,8 22,0 ± 0,8 21,3 ± 1,3 23,6 ± 1,4 *

Альбумин/Глобулины 1,6 ± 0,0 1,5 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,4 ± 0,1 *@

Mean - среднее значение; SD - стандартная ошибка среднего; N -количество вариант в группе. АЛТ - аланин- аминотрансфераза; АСТ - аспартат-аминотрансфераза; ЩФ - щелочная фосфатаза; * - P<0,05 относительно группы 1; # - P<0,05 относительно группы 2; @ - P<0,05 относительно группы 3, тест Kruskal-Wallis.

Таблица 21. Результаты биохимического анализа сывороток крови крыс на 15 день иммунизации самок.

Группы Носитель Вакцина «Гам-УЬР-рота»

Плацебо 30 мкг/доза 120 мкг/доза 600 мкг/доза

День 15 Mean±SD, N=6 Mean±SD, N=6 Mean±SD, N=6 Mean±SD, N=6

Глюкоза, ммоль/л 6,0 ± 0,4 5,8 ± 0,4 6,0 ± 0,3 6,3 ± 0,3

Мочевина, ммоль/л 7,3 ± 0,9 8,3 ± 1,8 7,7 ± 1,5 7,4 ± 0,8

Холестерин, ммоль/л 1,80 ± 0,15 1,91 ± 0,19 1,85 ± 0,32 1,89 ± 0,22

Триглицериды, ммоль/л 0,60 ± 0,23 0,64 ± 0,17 0,61 ± 0,08 0,62 ± 0,07

АЛТ, Ед/л 48 ± 5 48 ± 4 45 ± 6 54 ± 7

АСТ, Ед/л 103 ± 12 98 ± 10 105 ± 16 99 ± 13

Общий билирубин, мкмоль/л 3,3 ± 0,7 3,5 ± 0,8 3,0 ± 0,8 3,2 ± 1,1

Креатинин, мкмоль/л 52 ± 4 54 ± 6 56 ± 10 52 ± 3

ЩФ, Ед/л 397 ± 48 445 ± 41 389 ± 60 432 ± 44

Альбумин, г/л 34,2 ± 0,8 34,1 ± 0,9 33,4 ± 0,6 33,8 ± 0,9

Кальций, ммоль/л 2,57 ± 0,06 2,57 ± 0,04 2,54 ± 0,07 2,56 ± 0,03

Неорганические фосфаты, ммоль/л 2,56 ± 0,23 2,64 ± 0,26 2,67 ± 0,29 2,47 ± 0,10

№+, ммоль/л 143,5 ± 2,1 142,4 ± 1,2 141,2 ± 3,0 142,1 ± 1,0

К+, ммоль/л 4,31 ± 0,19 4,30 ± 0,23 4,33 ± 0,29 4,29 ± 0,17

СГ, ммоль/л 102,9 ± 2,3 102,1 ± 1,3 101,2 ± 2,9 101,7 ± 1,0

Общий белок, г/л 55,1 ± 1,4 55,1 ± 1,9 54,3 ± 1,7 55,4 ± 2,1

Глобулины, г/л 20,8 ± 0,8 21,1 ± 1,0 20,9 ± 1,1 21,7 ± 1,3

Альбумин/Глобулины 1,6 ± 0,1 1,6 ± 0,0 1,6 ± 0,1 1,6 ± 0,1

Mean - среднее значение; SD - стандартная ошибка среднего; N -количество вариант в группе. АЛТ - аланин- аминотрансфераза; АСТ - аспартат-аминотрансфераза; ЩФ - щелочная фосфатаза.

Так же было проведено микроскопическое обследование органов и области введения вакцины. Микроскопические отклонения, имеющие потенциальную связь с действием вакцины «Гам-УЬР-рота» в дозе 600 мкг/животное после однократного введения были исследованы на 2 -й день и на 15-й день.

В надпочечниках у самок группы большой дозы на 15 -й дни наблюдалась более выраженная вакуолизация клеток пучкового слоя, чем в группе носителя. Учитывая тот факт, что изменения в надпочечниках носили слабовыраженный характер, в меньшей степени наблюдались в группе носителя, эти изменения можно рассматривать, как условно связанными с действием тестируемого объекта, но не имеющими токсикологической значимости.

В паховых лимфатических узлах у самцов группы большой дозы тестируемого объекта на 2-й и 15-й дни наблюдался более выраженный отек по сравнению с группой носителя, у самцов и самок группы большой дозы на 15 -й день выявлены синусный гистиоцитоз и гиперплазия лимфоидных фолликулов в большей степени, чем в группе носителя. Так как паховые лимфатические узлы дренируют лимфу, оттекающую от нижних конечностей, где производилась инъекция тестируемого объекта, вышеуказанные признаки следует рассматривать как умеренно выраженные реактивные изменения, ассоциированные с действием исследуемого тестируемого объекта.

В брыжеечных лимфатических узлах в группе большой дозы тестируемого объекта у самцов на 2 день наблюдались отек, синусный гистиоцитоз и гиперплазия лимфоидных фолликулов в большей степени выраженности, чем в группе носителя и у самок в обеих группах - носителя и тестируемого объекта. Принимая во внимание тот факт, что данные изменения наблюдались только у самцов, были слабовыраженными, а на 15 -й день наблюдались данные изменения в обеих группах приблизительно с равной частотой и степенью выраженности, можно сделать вывод об условной связи с действием тестируемого объекта и не имеющими токсикологической значимости.

В базальных отделах слизистой оболочки желудка у самок группы большой дозы тестируемого объекта на 2-й и 15-й дни была выявлена очаговая инфильтрация эозинофилами. С учетом слабовыраженных изменений, а также наличия подобного признака в группе носителя, можно рассматривать, как условно связанным с действием тестируемого препарата, но не имеющим токсикологической значимости.

В печени на 2-й день у самок в группе большой дозы тестируемого объекта отмечено неравномерное накопление гликогена в гепатоцитах, рассеянная лимфоцитарная инфильтрация в портальных трактах и очаговый апоптоз гепатоцитов, при этом в группе носителя данные признаки были выражены минимально. Учитывая то, что у крыс неравномерное накопление гликогена часто является фоновым процессом, что также наблюдалось в группе носителя, лимфоцитарная инфильтрация была слабовыраженной, очаговой, без признаков активного или хронического воспаления, а очаговые апоптозы гепатоцитов могут встречаться спонтанно, данные признаки не имеют токсикологической значимости и является в большей степени реактивными изменениями.

Микроскопические отклонения, не связанные с действием тестируемого объекта «Гам-VLP-рота» в дозе 600 мкг после однократного введения, выявленные на 2-й день и на 15-й день.

В процессе микроскопического обследования были выявлены отклонения, которые наблюдались приблизительно с одинаковой частотой, как у животных в

группе носителя, так и у животных, получавших тестируемый объект в большой дозе. Такие отклонения являлись фоновыми, часто встречающими у крыс и были выявлены в следующих органах:

• в почках у самок группы большой дозы тестируемого объекта и группы носителя на 2-й день и 15-й дни в виде присутствия микролитов юкстамедуллярно;

• в селезенке у самцов и самок группы большой дозы тестируемого объекта и группы носителя на 2-й день и 15-й день в виде очагов экстрамедуллярного кроветворения;

• в печени у самцов и самок группы большой дозы тестируемого объекта и группы носителя на 2-й и 15-й день в виде неравномерного накопления гликогена в цитоплазме гепатоцитов;

• в подчелюстных лимфатических узлах у самцов и самок группы большой дозы тестируемого объекта и группы носителя на 2-й день и 15-й день в виде неравномерной фолликулярной гиперплазии.

В месте инъекции у самок группы большой дозы тестируемого объекта и группы носителя на 2-й день наблюдались идентичные по выраженности изменения в виде рассеянной инфильтрации эпимизия и перимизия нейтрофилами и эозинофилами, у самцов группы носителя на 2-й день наблюдались идентичные изменения. На 15-й день у самцов и самок в группе большей дозы, так же, как и в группе носителя признаков воспаления и прочих повреждений со стороны скелетной мышцы и прилегающей соединительной ткани с нервными стволиками не наблюдалось. Таким образом, можно сделать заключение, что указанные признаки не были связаны с действием тестируемого объекта, а в наибольшей степени, возможно, обусловлены процедурой введения.

Результаты микроскопического обследования органов и области введения тестируемого объекта в остром периоде, а также через 14 дней позволяют сделать заключение о том, что вакцина «Гам-УЪР-рота» в дозе 600 мкг после однократной внутримышечной инъекции в четырехглавую мышцу бедра не оказала общетоксического и местно-раздражающего действия. Следует отметить, что

через 14 дней после введения было обнаружено увеличение паховых лимфатических узлов без признаков воспалительной патологии, что расценено как реактивные изменения. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии признаков острой токсичности исследуемой VLP-вакцины против ротавирусной инфекции человека при однократном введении крысам. Ни в одном из анализируемых параметров: биохимические параметры сыворотки и микроскопическое обследование органов и области введения у грызунов - не было выявлено значимых отклонений по сравнению с контрольной группой. Также не наблюдалось смертности и признаков локального воспаления, выходящих за рамки физиологической нормы.

3.3.2 Результаты исследования иммуногенности вакцины