Разработка платформенной технологии получения биологически активных пептидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Хасаншина Зухра Рамилевна

• Хасаншина Зухра Рамилевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Хасаншина Зухра Рамилевна

Реферат

Synopsis

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.1 Биологически активные пептиды и их роль в индустрии

1.2 Применение биологически активных пептидов в пищевой промышленности

1.3 Способы получения биологически активных пептидов

1.4 E. coli как экспрессионная система: достоинства и недостатки

1.5 Стратегии улучшения экспрессии биологически активных пептидов

1.5.1 Архитектура генов

1.5.2 Вспомогательные последовательности

1.5.3 Штаммы-хозяева

1.5.4 Условия культивирования штаммов-продуцентов биологически активных пептидов

1.6 Выбор стратегии очистки пептидов для использования в пищевой индустрии

1.7 Банки клеток в пищевой промышленности

1.8 Современные подходы к разработке условий культивирования и

выделения и очистки рекомбинантных пептидов для пищевой промышленности

1.9 Оценка безопасности пептидов, полученных платформенной технологией,

и перспективы их применения в пищевой промышленности

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Схема исследования

2.2 Реактивы и материалы

2.3 Штаммы-продуценты

2.4 Среды и добавки, использованные при культивировании

2.5 Создание штаммов-продуцентов пептидов и ULP-1 протеазы

2.6 Получение и характеризации предварительного банка клеток

2.6.1 Получение предварительных банков клеток

2.6.2 Исследование чистоты банков клеток

2.6.3 Исследование структурной и сегрегационной стабильности плазмид

2.7 Подготовка посевного материала

2.8 Разработка условий культивирования в колбах

2.9 Классические условия культивирования бактериальных штаммов-

продуцентов пептидов в механическом биореакторе в периодическом режиме

2.10 Культивирование бактериальных продуцентов пептидов в механическом

биореакторе в периодическом режиме

2.11 Выделение и очистка рекомбинантных пептидов

2.12 Культивирование штамма-продуцента ULP-1 протеазы в механическом биореакторе в периодическом режиме

2.13 Выделение и очистка ULP-1 протеазы

2.14 Определение содержания гибридных белков пептидов и ULP-протеазы в биомассе клеток E. coli и тельцах включения методом капиллярного гель-электрофореза

2.15 Измерение оптической плотности культуры

2.16 Измерение свободного аминного азота в культуральной жидкости

2.17 Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.18 Определение содержания пептидов методом обращено-фазной ВЭЖХ

2.19 Определение подлинности гибридных белков пептидов, пептидов, ULP-1 протеазы методом ВЭЖХ-МС

2.20 Определение белков штамма-продуцента

2.21 Определение содержания бактериальных эндотоксинов

2.22 Определение концентрации белка

2.23 Определение содержания ДНК методом ПЦР в реальном времени

2.24 Определение остаточных технологических реагентов методом газовой хроматографии

2.25 Определение остаточных технологических реагентов методом ВЭЖХ

2.26 Микробиологическая чистота

2.27 Пептидное картирование

2.28 Круговой дихроизм

2.29 Определение содержания тяжёлых металлов и никеля

2.30 1п silico анализ безопасности и стабильности пептидов

2.31 Определение стабильности мРНК методом ПЦР в реальном времени

2.32 Статистическая обработка результатов исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка технологии получения пептидов

3.1.1 Разработка штаммов-продуцентов пептидов

3.1.2 Разработка технологии периодического культивирования

3.1.3 Масштабирование технологии периодического культивирования

3.1.4 Разработка препаративной технологии очистки биологически активных пептидов

3.1.5 Масштабирование технологии очистки пептидов

3.2 Разработка технологии получения ЦЪР-1 протеазы

3.2.1 Разработка штамма-продуцента ЦЪР-1 протеазы

3.2.2 Разработка технологии культивирования штамма-продуцента ЦЪР-1 протеазы

3.2.3 Разработка технологии выделения и очистки ЦЪР-1 протеазы

3.2.4 Масштабирование технологии получения ЦЬР-1 протеазы

3.3 Характеристика финальных продуктов и оценка их соответствия требованиям безопасности для пищевой индустрии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Реферат

Актуальность работы. В последнее десятилетие биологически активные пептиды приобрели большой интерес в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности благодаря уникальным свойством, которое заключается в сочетании биологической активности и безопасности. Их способность оказывать направленное физиологическое действие делает перспективными компонентами функциональных пищевых продуктов и биологически активных веществ, направленных на профилактику метаболических, сердечно-сосудистых и воспалительных нарушений. Включение пептидов в пищевые матрицы открывает возможности для обогащения рациона нутрицевтическими компонентами, обладающими доказанным эффектом в терапии сахарного диабета и ожирения. Также они нашли широкое применение в составе косметических композиций с антивозрастной и функциональной направленностью.

По оценке аналитических агентств, мировой рынок пептидных препаратов продолжает стремительно расти. Около 80 пептидных препаратов одобрено, более 150 проходят клинические исследования. Согласно прогнозам, мировой рынок пептидных препаратов достигнет объема более 68,7 млрд долларов США к 2030 году [4,7,12,20]. Параллельно увеличивается сегмент биологически активных пептидов в пищевой и косметической индустрии, оцениваемый в более чем 4 млрд долларов США с прогнозом роста до 7-8 млрд долларов США к 2030 году. Основными драйверами этого роста являются повышенный спрос на функциональные продукты питания и биологически активные добавки [1, 2].

Увеличение интереса к пептидам ставит перед наукой и промышленностью задачу создания эффективных, экологичных и экономически оправданных технологий. Существующие методы производства пептидов имеют ряд ограничений. Химический синтез несмотря на высокий уровень автоматизации, приводит экологическим и экономическим сложностям. Данный факт связан с использованием токсичных растворителей, образованием побочных продуктов,

ограничениями в длине синтезируемой молекулы и сложности масштабирования. При ферментативном гидролизе индустрия сталкивается со сложностью в стандартизации финального продукта и вариабельностью от серии к серии сырья животного и растительного происхождения. Эти факторы не только влияют на устойчивость, но и препятствуют крупномасштабному коммерческому производству.

Одним из перспективных способов решения данной проблемы является использованием биотехнологических методов. Экспрессия пептидов в микробных системах экспрессии, прежде всего в Escherichia coli, может стать экономически выгодной и экологически безопасной альтернативой химическому синтезу. Однако применение E. coli в качестве экспрессионной системы связано с рядом сложностей: низкой растворимостью и протеолизом целевого продукта, образованием телец включения, нестабильностью мРНК и низким выходом при экспрессии коротких пептидов. Кроме того, каждая молекула требует индивидуального подхода к подбору условий экспрессии, выделения и очистки, что удлиняет и удорожает процесс разработки.

В связи с этим разработка универсальной платформенной технологии, позволяющей эффективно производить широкий спектр биологически активных пептидов, включая трудноэкспрессируемые и нестабильные, является актуальной задачей для биотехнологии. Платформенные решения, предполагающие использование стандартных продуцентов, унифицированных протоколов культивирования и очистки, доказали свою эффективность в фармацевтической промышленности, однако в сфере пищевой биотехнологии они пока недостаточно реализованы. В том числе в Российской Федерации в настоящее время не существует эффективной технологии производства пептидов биотехнологическим способом для пищевой промышленности.

Таким образом, разработка эффективной, масштабируемой технологии получения биологически активных пептидов является актуальной научной и прикладной задачей. Решение этой проблемы имеет решающее значение для продвижения отечественных инноваций, улучшения доступности функциональных

продуктов питания и укрепления глобальной конкурентоспособности в секторе биотехнологий.

Целью диссертационной работы является разработка и реализация платформенной технологии получения биологически активных пептидов с антиоксидантными и иммунотропными свойствами на основе экспрессионной системы Escherichia coli, потенциально пригодных для применения в составе функциональных пищевых продуктов.

Для достижения данной цели в рамках диссертации были поставлены и решены следующие задачи:

1. Создать рациональные экспрессионные конструкции для экспрессии биологически активных пептидов с антиоксидантной и иммунотропной свойствами на основе Escherichia coli BL21.

2. Разработать конструкцию гена и создать штамм-продуцент Escherichia coli BL21 для получения ULP-1 протеазы в форме телец включения.

3. Определить рациональные условия экспрессии ULP-1 протеазы в E. coli BL21, обеспечивающим максимальный выход белка в форме телец включения с сохранением биологической активности.

4. Определить рациональные условия культивирования штаммов-продуцентов E. coli BL21 для обеспечения стабильного роста и высокого уровня экспрессии гибридных белков пептидов.

5. Разработать эффективную технологию выделения и очистки биологически активных пептидов с антиоксидантными и иммунотропными свойствами.

6. Провести масштабирование технологии культивирования, выделения и очистки биологически активных пептидов и ULP-1 протеазы на опытно-промышленный участок.

7. Провести комплексную аналитическую оценку качества и безопасности пептидов, включая определение остаточной ДНК, белков штамма-продуцента, эндотоксинов, в соответствии с требованиями к биологически активным веществам алиментарного назначения.

8. Разработать технологическую документацию на производство биологически активных пептидов 1,2,3,4, обладающих антиоксидантной и иммунотропной активностью.

Методы исследования. В диссертации применялись ряд методов молекулярной биологии, биохимии, микробиологии и аналитической химии. Для создания экспрессионных конструкций и штаммов-продуцентов использовали методы генной инженерии, включая рестриктазно-лигазное и Golden Gate клонирование, трансформацию E. coli, отбор клонов. Для оценки стабильности матричной РНК использовали ПЦР в реальном времени. Подлинность экспрессионных конструкций подтверждали рестрикционным картированием и секвенированием по Сэнгеру.

Факторы для оптимизации условий культивирования выбирали с помощью анализа рисков. Условия культивирования оптимизировали как в колбах, так и в биореакторах в периодическом и периодическом с подпиткой режимах с применение методологии статистического моделирования. Для анализа накопления целевых продуктов и роста клеток во время ферментации применяли спектрофотомерию (оптическая плотность), взвешивание для оценки влажной массы клеток, измерение свободного аминного азота, электрофорез в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле, капиллярный гель-электрофорез.

Очистка рекомбинантных пептидов проводилось с использованием многоступенчатых хроматографических методов, основанных на физико-химических свойствах целевых белков. Для удаления N-концевых тегов использовали ферментативную обработку с высокоспецифичной ULP-1 протеазой, обеспечивающей точное расщепление по структуре SUMO без остаточных аминокислот.

Чистота продуктов подтверждалась методами SDS-PAGE, капиллярного гель-электрофореза, обращено-фазной ВЭЖХ, а также тестами на бактериальные эндотоксины, остаточную ДНК и белки-хозяина, соответствующими требованиям разработки биотехнологических продуктов, а также применение в различных

приложениях. Подлинность продуктов подтверждали масс-спектрометрией на всех этапах разработки. Для оценки качества и пищевой безопасности пептидов проведены количественная ПЦР (остаточная ДНК), ЛАЛ-тест (эндотоксины), ИФА (белки-хозяина), масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой, ВЭЖХ и ГХ (остаточные реагенты), а также микробиологический анализ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Созданы стабильные штаммы-продуценты E. coli BL21/pF1220, BL21/pF1223, BL21/pF1252, BL21/pF1253 для экспрессии SUMO-гибридных белков.

2. Разработана конструкция с синтетической шпилькой в 3'-нетранслируемой области мРНК, обеспечивающая повышение продуктивности штаммов-продуцентов биологически активных пептидов на основе E. coli BL21.

3. Получена ULP-1 протеаза в виде солюбилизата телец включения, применяемая без стадии рефолдинга.

4. Разработаны рациональные условия периодического культивирования с подкормкой штаммов-продуцентов штаммы-продуценты E. coli BL21/pF1220, BL21/pF1223, BL21/pF1252, BL21/pF1253, обеспечивающие объёмную продуктивность до 5,54 г/л.

5. Разработана технология получения четырех биологически активных пептидов, состоящая из дезинтеграции клеток E. coli BL21, сочетании применения металл-хелатной и обращено-фазной хроматографии, обеспечивающая получение биологически активных пептидов, обладающих антиоксидантной и иммунотропной активностью, с чистотой не менее 96% и стабильностью при хранении.

Научная новизна диссертации отражена в следующих пунктах:

1. Установлено, что разработанные штаммы E. coli BL21/pF1220, BL21/pF1223, BL21/pF1252 и BL21/pF1253 обеспечивают стабильную экспрессию SUMO-гибридных белков с короткими пептидами при потере плазмиды менее 0,4 % за 7 пассажей, что соответствует требованиям промышленной биотехнологии.

2. Показано, что введение искусственной структуры стержень-петля в 3' -нетранслируемую область мРНК увеличивает период полураспада с 3-4 до 9,93 мин и повышает удельную продуктивность в 6,6-12,6 раз (до 61,6 мг/г, 6,54 г/л) в штамме-продуценте E. coli BL21.

3. Установлено, что использование солюбилизата телец включения ULP-1 протеазы без стадии рефолдинга обеспечивает полную конверсию SUMO-гибридных белков за 1 ч и снижает себестоимость процесса более чем в 2 раза.

4. Обоснованы параметры процесса периодического культивирования с подпиткой штаммов-продуцентов E. coli BL21/pF1220, BL21/pF1223, BL21/pF1252, BL21/pF1253 (= 37 °C, pH = 7,5, OD600 = 30, ИПТГ = 0,05 мМ, профиль подачи глюкозы в режиме pH-стат и азотной подкормки с 0,82 до 1,37 мл/мин), позволяющие достигать максимальной продуктивности до 5,54 г/л гибридного белка.

5. Показано, что универсальный метод очистки на основе металл-хелатной и обращено-фазной хроматографии обеспечивает получение пептидов с чистотой >96 %, минимальным содержанием примесей и стабильностью более 6 мес. при -20 °C.

Теоретическая и практическая значимость работы

Доказано, что применение платформенной технологии включающую генетические конструкции, штамм E. coli BL21, условия культивирования и выделения и очистки расширяет возможности получения биологически активных пептидов с разными свойствами, на основе которых возможно создание пищевых ингредиентов для пищевой промышленности.

Предложена методология биотехнологического получения рекомбинантных пептидов - основы для функциональных продуктов питания, включающая генно-инженерные конструкций, условия культивирования, выделения и очистки для штамма E. coli BL21.

Разработаны и внедрены в производство технологии получения четырёх пептидов, обладающих антиоксидантными и иммунотропными свойствами,

ориентированных на применении в составе функциональных пищевых продуктов. Технологии прошли промышленную апробацию на площадке ООО ГЕРОФАРМ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка платформенной технологии получения биологически активных пептидов»

Апробация работы

Направления диссертационного исследований и результаты были представлены на различных конференциях: VIII Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков (Новосибирск, 2021), XIII конференция Математическое модели и численные методы в биологии и биомедицине (Москва, 2021), конференция научно-исследовательского центра ГЕРОФАРМ (Санкт-Петербург, 2021), Всероссийская конференция Биоресурсные коллекции: современное состояние и потенциал для создания новых технология и инновационной продукции в Российской Федерации (Сочи, 2022), IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков (Новосибирск, 2022), Саммит разработчиков лекарственных препаратов Сириус-Биотех (Сочи, 2023), II Всероссийская школа-конференция «Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» (Санкт-Петербург, 2023), III Международная конференция «Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» (Санкт-Петербург, 2024), XVIII конгресс Разработка и регистрация лекарственных средств (Москва, 2025)

Достоверность научных достижений

Все исследования были выполнены с учетом трёхкратного повторения. Полученные результаты обработаны при помощи математической статистики и вычисления доверительного интервала при уровнях доверия р=0.95 используя программное обеспечение GraphPad Prism 8. Для построения уравнений регрессии и расчета описательной статистики полученных математических моделей использовали программное обеспечение MODDE 12.1.

Внедрение результатов работы

Технология получения биологически активных пептидов, обладающих антиоксидантной и иммунотропной активностью, и ULP-1 внедрены на

промышленное производства на площадке ООО ГЕРОФАРМ. Платформенная технология получения биоактивных пептидов и способ оптимизации 3'-нетрансилируемой области экспрессионной конструкции внедрены и активно используются в разработке новых продуктов в ЗАО «Фарм-Холдинг» (научно-исследовательский центр ГЕРОФАРМ).

Личный вклад автора

Автор принимала активное участие в проведение литературного обзора по теме рекомбинантных пептидов и их применения в пищевой промышленности. Автором была обоснована стратегия платформенной технологии получения биологически активных пептидов алиментарного назначения, сформулированы цели и задачи исследования, проведена оценка пищевой пригодности целевых продуктов. Автор разработала план исследования, принимала активное участие в разработке высокопродуктивных штаммов-продуцентов, технологии культивирования и очистки биологически активных пептидов с антиоксидантными и иммунотропными свойствами и ЦЪР-1 протеазы.

Автором совместно с сотрудниками лаборатории разработки биопроцессов ЗАО «Фарм-Холдинг» были выполнены работы по разработке технологии выделения и очистки пептидов и ЦЪР-1 протеазы. Автором совместно с сотрудниками испытательно аналитической лаборатории и лаборатории фармакологии ЗАО «Фарм-Холдинг» были выполнены работы по разработке методов контроля качества пептидов и ЦЪР-1 протеазы, включая определение чистоты, идентичности, остаточных примесей и безопасности целевых продуктов. Автором совместно с сотрудниками производственной площадкой ООО ГЕРОФАРМ в пгт Оболенск и сотрудниками Департамента биотехнологий выполнен перенос технологии культивирования и очистки пептидов и ЦЪР-1 протеазы на производственную площадку ООО ГЕРОФАРМ.

Автор проводила анализ полученных данных и интерпретировала результаты. Автор совместно с соавторами подготовила материалы для научных публикаций и докладов на конференциях.

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в журналах, индексируемых в SCOPUS.

Способ получения пептидов защищён патентом № RU2023116364A (WO2024263059A1) на изобретение «Гибридные белки-предшественники пептидных иммуногенов — компонентов вакцины против COVID-19» (дата публикации 23.12.2024). Авторами изобретения являются Хасаншина Зухра Рамилевна, Латыппов Виталий Феликсович, Корнаков Игорь Александрович, Буслаева Евгения Александровна, Ищук Сергей Александрович, Казакова Ангелина Владимировна. Патентообладателем является Общество с ограниченной ответственностью «ГЕРОФАРМ».

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 302 страницах и состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы и приложения. Диссертация содержит 32 рисунка, 20 таблиц, 2 приложения, в список литературы включены 310 источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введение раскрыта актуальность разработки эффективных технологий получения биологически активных пептидов, предназначенных для использования в пищевой индустрии. Поставлены цели и задачи исследования, обозначена научная новизна и практическая значимость работы, перечислены основанные положения, выносимые на защиту.

В первой главе диссертации представлен обзор литературы, посвященный аспектам разработки платформенной технологии для получения биологически активных пептидов, с фокусом на их применение в функциональных пищевых продуктах, специализированном питании. Рассматриваются пептиды алиментарного назначения, их физиологическая роль, перспективы и регуляторные аспекты их применения. В обзоре также рассмотрены различные способы получения пептидов, включая химический синтез, ферментативный гидролиз и технология рекомбинантной ДНК. Особое внимание уделено использованию экспрессионной системы на основе Escherichia coli. Представлены достоинства и

недостатки каждого из методов. Приведена информация о ключевых этапах разработки платформенных технологий: генно-инженерная конструкция, выбор штамма-продуцента, оптимизация условий культивирования и очистки. Обоснована актуальность повышения стабильности мРНК как одного из ключевых факторов повышения продуктивности в экспрессии белков и пептидов. Также рассмотрены методы повышения чистоты и безопасности целевых продуктов в соответствии с требованиями пищевой промышленности. Был сделан вывод о необходимости о создания платформенной технологии, ориентированной на промышленное производство биологически активных пептидов, соответствующих требованиям пищевой безопасности, стабильности и функциональности.

Объектами исследования выступили:

— Штамм E. coli BL21.

— ULP-1 протеаза.

— Пептиды 1,2,3,4, обладающие антиоксидантной и иммунотропной активностью.

Материалы и методы проведения исследований представлены во второй главе. Исследование проводилось на базе ЗАО «Фарм-Холдинг». Часть исследований в области разработки технологии получения пептидов выполнена в рамках государственного задания (проект FSER-2025-0028). Схема исследования была аналогична для разработки штаммов-продуцентов и технологии получения пептидов и ULP-1 протеазы представлена на Рисунке 1.

Масштабирование технологии культивирования для промышленного уровня

Масштабирование технологии выделения и очистки до промышленного уровня

Разработка препаративной методики выделения и очистки

Рисунок 1 . Схема проведения исследования

В работе использовали 4 пептида, которые представляют собой биологически активные вещества алиментарного назначения. Благодаря своим структурным и физико-химическим свойствам эти пептиды рассматриваются как перспективные ингредиенты для использования в составе специализированных пищевых продуктов, нутрицевтиков и биологически активных добавок. Их характеристики, включая молекулярную массу, гидрофобность и изоэлектрическую точку, легли в основу выбора технологических решений на этапах выделения и очистки и представлены в Таблице 1.

Таблица 1. — Физико-химические свойства пептидов

Наименование пептида Теоретическая молекулярная масса, Да Изоэлектрическая точка Количество аминокислот GRAVY индекс

Пептид 1 2 959 6,06 25 -0,923

Пептид 2 2 687 5,32 23 -0,912

Пептид 3 2 642 5,58 22 -0,929

Пептид 4 3 810 5,47 32 -0,921

В работе использованы современные методы молекулярной биологии, микробиологии, биохимии и аналитической химии, обеспечивающие разработку и валидацию технологии получения биологически активных пептидов для применения в составе пищевых продуктов и биологически активных добавок.

Для создания рекомбинантных штаммов-продуцентов E. coli, экспрессирующих SUMO-гибридные белки и ULP-1 протеазу, использовали амплификацию фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции, рестрикцию, лигирование, трансформацию методом электропорации, отбор на селективных питательных средах. Гены синтезировали химико-ферментативным методом. Для подтверждения подлинности конструкций использовали рестрикционное картирование и секвенирование по Сэнгеру.

Анализ стабильности мРНК проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Транскрипцию останавливали с помощью рифампицина, использовали

праймеры к целевому и контрольному гену. Расчет периода полураспада проводили с помощью однофазного экспоненциального распада.

Для каждого штамма-продуцента были получены предварительные банки клеток. Для них проведена оценка структурной и сегрегационной стабильности плазмид в течение 7 пассажей при культивировании на селективной и неселективной питательных средах.

Культивирование клеток проводили в колбах и биореакторах (Biostat B Satrorius, Германия) в периодическом режиме с подпиткой. Во время ферментации контролировали рН питательной среды, температуру культивирования, концентрацию растворенного кислорода, скорость аэрации и перемешивания. Оптимизацию условий индукции экспрессии белков проводили с применением подхода статистического моделирования, а именно Reduced Central Composite Face дизайна и программного обеспечения MODDE 12.1 (Sartorius, Германия). Анализ продуктивности осуществляли методами капиллярного гель-электрофореза в денатурирующих условиях (BioPhase 8800, SCIEX, США), электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Рост клеток контролировали с помощью спектрофотометрии при длине волны 600 нм и взвешивания для оценки концентрации влажной массы клеток. Во время культивирования оценивали потребление аминного азота с помощью модифицированной нингидриновой реакции.

Очистку ULP-1 проводили с использованием металл-хелатной хроматографии. Для первичного скрининга условий гидролиза использовали модельный белок SUMO-соматотропин, ранее полученный в ЗАО «Фарма-Холдинг».

Очистку рекомбинантных SUMO-гибридных белков проводили методами металл-хелатной и обращено-фазной хроматографии с использованием систем AKTA Pure (GE Healthcare, США) и сорбентов Ni-Seplife 6FF, Daisogel SP-100. Гидролиз гибридных белков проводили in vitro с использованием ULP-1 протеазы. Степень очистки целевых продуктов подтверждали методами обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием сорбента с С-

18 концевыми группами (хроматографическая колонка Jupiter 5u C18 300Â, 250x4.6 mm, Phenomenex) на хроматографе Acquity UPLC (Waters, США) и капиллярного электрофореза. Подлинность целевых белков подтверждали масс-спектрометрией с использованием ВЭЖХ системы Aquity с одноквадрупольным масс-спектрометрическим детектором SQ Detector 2 (Waters, США). Для оценки качества и пищевой безопасности пептидов проведены количественная ПЦР (остаточная ДНК), ЛАЛ-тест (эндотоксины), ИФА (белки-хозяина), масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой, ВЭЖХ и ГХ (остаточные реагенты), а также микробиологический анализ. Биоинформатический анализ с помощью AllerTOP v.2, ToxinPred использовали для подтверждения отсутствия аллергенного и токсического потенциала. С помощью PeptideCutter показали гидролизуемость пептидов пищеварительными ферментами.

При масштабировании процессов из колб в биореактор лабораторного масштаба и из лабораторного биореактор в опытно-промышленный учитывали параметры, определенные в ходе оптимизации условий, с последующей адаптацией режима культивирования: поддерживали рН с помощью рН-стата, концентрацию растворенного кислорода с помощью каскадного регулирования скорости перемешивания и подачи сжатого воздуха. Масштабирование хроматографических стадий проводилось с сохранением с сохранением высот столбов сорбентов, линейных скоростей потоков и нагрузок на сорбенты. Оценку воспроизводимости масштабирования проводили по удельной и объемной продуктивности для процессов культивирования и показателям чистоты и выхода целевого белка для процессов выделения и очистки.

Основные результаты экспериментальных исследований Разработка штаммов-продуцентов биологически активных пептидов В работе использовали 4 биологически активных пептида, представляющих собой короткие рекомбинантные последовательности 22-32 аминокислотных остатка, перспективные для применения в составе функциональных пищевых продуктов и биологически активных добавок алиментарного назначения. Для повышения растворимости и стабилизации экспрессируемых пептидов они были

получены в виде гидридных белков с SUMO, что обеспечивает защиту от деградации, высокую растворимость и возможность универсальной очистки [172]. В ходе разработки штаммов-продуцентов гибридных белков были получены штаммы, представленные в Таблице 2.

Таблица 2. — Общая характеристика штаммов-продуцентов и экспрессируемого продукта

Наименование пептида Теоретическая молекулярная масса, Да Штаммы-продуценты

Гибридный белок SUMO-пептид 1 15 619 BL21\pF1220

Гибридный белок SUMO-пептид 2 15 347 BL21\pF1223

Гибридный белок SUMO-пептид 3 15 302 BL21\pF1222, BL21\pF1253

Гибридный белок SUMO-пептид 4 16 479 BL21\pF1225, BL21\pF1252

На первом этапе работы были получены 4 генетические конструкции, несущие ген гибридных белков целевых пептидов под контролем Tac промотора. Подлинность подтверждена секвенированием по Сэнгеру. Все кодирующие последовательности были оптимизированы по составу кодонов [76]. Далее были получены 4 штамма-продуцента, несущие плазмиды pF1220, pF1222, pF1223 и pF1225, и экспрессируемых в клетках E. coli штамма BL21.

Лучшие по продуктивности клоны демонстрировали уровень экспрессии гибридного белка по отношению к общему количеству бактериальных белков 14,60% (клон 1), 5,50% (клон 1), 19,36% (клон 3), 8,78% (клон 1) для BL21\pF1220, BL21\pF1222, BL21\pF1223, BL21\pF1225 соответственно (Рисунок 2). Таким образом, после первичного скрининга показано, что штаммы-продуценты BL21\pF1220, BL21\pF1223 обеспечивают высокий уровень экспрессии. В то время как штаммы-продуценты BL21\pF1222, BL21\pF1225 демонстрируют низкую продуктивность.

А Б

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

10

Рисунок 2. Электрофореграмма трех клонов штаммов-продуцентов пептидов. A) Штамм BL21\pF1220. 1 - Маркер молекулярных масс; 2 - контрольный штамм без добавления ИПТГ; 3 - контрольный штамм с добавлением ИПТГ; 4 -клон 1 без добавления ИПТГ; 5 - клон 1 с добавлением ИПТГ; 5 - клон 2 без добавления ИПТГ; 6 - клон 2 с добавлением ИПТГ; 7 - клон 3 без добавления ИПТГ; 8 - клон 3 с добавлением ИПТГ. Б) Штамм BL21\pF1222 и BL21\pF1223.

1 - клон 1 BL21\pF1222 без ИПТГ; 2 - клон 1 BL21\pF1222 с ИПТГ; 3 - клон 2 BL21\pF1222 без ИПТГ; 4 - клон 2 BL21\pF1222 с ИПТГ; 5 - клон 3 BL21\pF1222 без ИПТГ; 6 - клон 3 BL21\pF1222 с ИПТГ; 7 - клон 1 BL21\pF1223 без ИПТГ; 8 -

клон 1 BL21\pF1223 с ИПТГ; 9 - клон 2 BL21\pF1223 без ИПТГ; 10 - клон 2 BL21\pF1223 с ИПТГ; 11 - клон 3 BL21\pF1223 без ИПТГ; 12 - клон 3 BL21\pF1223 с ИПТГ; 13 - контроль стандарта пептида; 14 - контроль стандарта SUMO; 15 - маркер молекулярных масс. В) Штамм BL21\pF1225. 1 - Маркер молекулярных масс; 2 - клон 1 без добавления ИПТГ; 3 - клон 1 с добавлением ИПТГ; 4 - клон 1 без добавления ИПТГ; 5 - клон 2 без добавления ИПТГ; 6 - клон

2 с добавлением ИПТГ 4 часа индукции; 7 - клон 2 без добавления ИПТГ; 8 -

клон 3 без добавления ИПТГ; 9 - клон 3 с добавлением ИПТГ; 10 - клон 3 без добавления ИПТГ. Стрелкой обозначены бенды целевых гибридных белков.

Причиной низкого уровня экспрессии может быть токсичность целевого белка для штамма-хозяина, деградация белка, стабильность мРНК [181]. Для выявления причины была проведения ферментация в биореакторе. Показано, что после индукции, штамм-продуцент продолжает расти и поддерживает удельную скорость роста. Показано, что с течением времени не наблюдается деградация белка в клетке (Рисунок 3).

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Время индукции, ч

Рисунок 3. Оценка продуктивности штамма-продуцентов BL21\pF1222, BL21\pF1223, BL21\pF1225 стандартных условиях для культивирования E. coli

Таким образом, целевые гибридные белки, экспрессируемые штаммами-продуцентами BL21\pF1222, BL21\pF1225 не являются токсичными для штамма-хозяина и не подвергаются нецелевой протеолитической деградации. Выявлено, что для BL21\pF1222, BL21\pF1225 характерно значительное снижение периода полураспада мРНК целевого белка по сравнению с контрольным штаммом-продуцентом BL21\pF1223. Полученные данные свидетельствуют о том, что в данных конструкциях мРНК деградирует с высокой скоростью: период полураспада составляет менее 4 минут, тогда как для контрольной конструкции он достигает 9,93 минут (Рисунок 4). Это указывает на присутствие дестабилизирующих факторов в транскриптах pF1222 и pF1225, вероятно, связанных со структурными особенностями З'-нетранслируемой области [69-71, 74, 75, 77].

В целях увеличения стабильности транскриптов была разработана и внедрена

короткая стабильная РНК-последовательность длиной 25 пар нуклеотидов в 3'-нетранслируемую область. Подобные вставки могут формировать вторичную структуру, препятствующую доступу рибонуклеаз и тем самым замедляющую деградацию транскрипта [77]. Этот подход основан на известных механизмах регуляции стабильности мРНК в прокариотах, где элементы в З'-конце могут играть защитную роль [69-71, 74, 75, 77]. Период полураспада мРНК была повышена не менее чем в три раза, при этом удельная продуктивность была увеличена в 6,6 и 12,6 раз для штаммов-продуцентов, экспрессирующих гибридные белки пептида 4 и 3 соответственно (Рисунок 4).

А Б

Ы,21\рП223 В1.2Грр|222 ВЬ2ИрП2?2 ВЬ21 .рр!225 ВЬ21\рр1253

Нанменование штамма-продуцента Период полураспада ЛРНК, МНЕ

ВЬ21\рЕ1223 0,93 0,871

ВЬ21\рЕ1225 3,92 0,988

ВЬ21'.рБ1253 11,84 0,842

ВЬ21\рЕ1222 2,83 0,996

ВЬ21\рЕ1252 11,25 0,867

Рисунок 4. Оценка влияния структуры стержень-петля на А) стабильность мРНК; Б) продуктивность штаммов-продуцентов, экспрессирующих гибридные белки 3 и

4 пептида

Разработанный подход является универсальным элементом платформенной технологии экспрессии и может быть интегрирован в конструкции для получения различных пептидов, предназначенных для использования в пищевой промышленности. Он обеспечивает стабильное и эффективное производство коротких и нестабильных пептидов, что особенно актуально при разработке функциональных ингредиентов.

Таким образом, разработаны штаммы-продуценты БЬ21\рБ1220, БЬ21\рБ1222, БЬ21\рБ1252, БЬ21\рБ1253. Было показано, что штаммы-продуценты обладают высокой структурной и сегрегационной стабильностью

плазмид. Это подтверждено в ходе 7 последовательных пассажей в отсутствии селективного давления. Доля клеток, потерявших плазмиду, составило менее 0,4%, что соответствует промышленным требованиям к продуцентам, используемым в производстве компонентов пищевой продукции [134]. Разработанные штаммы формируют основу платформы для микробиологического получения широкого спектра биологически активных пептидов алиментарного назначения, применимых в пищевой и косметической индустрии.

Разработка и масштабирование технологии культивирования штаммов-продуцентов биологически активных пептидов

Была разработана и оптимизирована технология периодического культивирования с подпиткой, адаптированная под требования пищевой биотехнологии. Критические параметры процесса были определены с использованием анализа рисков и подхода «качества через разработку». Оптимизация условий индукций проведена с использованием статистического моделирования. Построены математические модели, описывающие зависимость удельной продуктивности и влажной массы клеток от параметров индукции (формула 1-8). Ключевые характеристики полученных моделей коэффициент детерминации и предсказательная способность были выше пороговых значений 0,80 и 0,50 соответственно. Следовательно полученные модели могут быть использованы для определения оптимальных условий индукции.

Рг = 1,16 - 0,05 * ^ + 0,05 * Х2 + 0,07 * Х3 - 0,06 * Х4 + 0,02 (1) *Х5- 0,15 * * Х3 - 0,04 * * Х4 + 0,03 * X, * Х4 + 0,03 * Х3 * Х4 - 0,03 * Х3 * Х5)

Р2 = 19,50 + 4,38 * ^ + 1,37 * Х2 + 9,87 * Х3 - 3,48 * Х4 - 0,92 * (2) - 4,31 * + 1,56 * Х2 * Х3 + 2,47 * * Х3 + 1,39 * ^ *Х4 + 3,35*Х2 *Х5

Р3 = 25,53 + 2,70 * X, + 3,34 * Х3 - 3,22 * Х4 - 2,32 * Х22 - 4,78 * X, (3) + 1,56 * X, * Х3 + 1,22 * X, * Х4

Р4 = 40,30 + 0,24 * X, + 1,11 * Х3 + 3,22 * Х4 - 1,03 * Х32 - 9,10 * Х42 (4)

Г1 = 65,94 + 13,29 * + 15,11 * X, + 7,50 * X3 + 1,39 * X4 + 0,02 (5)

* + 9,34 * * X3 - 8,19 * X4 *

Г2 = 101,727 + 12,61 * + 14,72 * X, + 5,44 * X3 - 21,55 * X4 (6) - 4,44 * - 34,17 * + 15,62 * X3 * X4 - 7,125 * X, *X4 + 9,625 *X, *X5

Г3 = 108,144 - 0,62 * X, - 6,80 * X3 + 12,18 * X4 - 1,20 * (7)

- 12,07 * Xf - 5,28 * X, * X3 + 3,98 * X4 * - 4,23 * X,

Г4 = 71,42 + 15,24 * X, - 1,13 * X3 + 12,61 * X4 - 12,44 * - 9,33 (8)

* ^3 * X4

где P1, P2, P3, P4 - удельная продуктивность штаммов-продуцентов BL21\pF1220, BL21\pF1223, BL21\pF1253, BL21\pF1252 соответственно, Y1, Y2, Y3, Y4 - концентрации влажной биомассы штаммов-продуцентов BL21\pF1220, BL21\pF1223, BL21\pF1253, BL21\pF1252 соответственно, Х1 - коэффициент для фактора «время индукции», Х2 - коэффициент - «оптическая плотность индукции», Х3 - коэффициент - «температура культивирования», Х4 - коэффициент - «рН питательной среды», Х5 - коэффициент - «концентрация ИПТГ».

Таким образом, установлено, что оптимальные условия индукции включают: температуру 37 ± 1 °C, pH 7,5 ± 0,5, оптическую плотность индукции 30 ± 5 и концентрацию ИПТГ 0,05 мМ. Эти параметры обеспечивают высокий уровень экспрессии гибридных белков, стабильный рост клеток. Это особенно важно при производстве пептидов пищевого назначения, где критичны безопасность и воспроизводимость. Было показано, что температура 37 ± 1 °C не влияет на продуктивность и не способствует агрегации белка, вероятно, за счет растворимости SUMO. Щелочной сдвиг рН питательной среды положительно влияет на рост клеток и биосинтез целевого продукта, вероятно, за счет снижения ацетатного стресса [111, 117, 178]. Показано, что концентрация индуктора не оказывает статистического значимого влияния на продуктивность, но при повышении концентрации может влиять на скорость роста клеток за счет токсичности и повышения метаболической нагрузки [179]. Минимально эффективная концентрация снижает себестоимость процесса [182, 183].

Оптимальной является середина логарифмической фаза роста, которая обеспечивает баланс между устойчивостью к метаболической загрузке и уровнем экспрессии. Модели прошли успешную валидацию в лабораторном биореакторе, предсказанные значения откликов соответствовали экспериментальным (Рисунок

5).

Рисунок 5. Экспериментальные и предсказанные значения удельной продуктивности штаммов-продуцентов BL21\pF1220, BL21\pF1223, BL21\pF1253, BL21\pF1252 в оптимальных условиях культивирования Кинетика роста штаммов-продуцентов и накопление целевых белков представлены на Рисунках 6 и 7.

Рисунок 6. Кинетика роста клеток и накопления целевого продукта после индукции. А) BL21\pF1220. Б) BL21\pF1223.

Время культивирования, ч Время культивирования, ч

Рисунок 7. Кинетика роста клеток и накопления целевого продукта после индукции. А) BL21\pF1253. Б) BL21\pF1252.

Проведено успешное масштабирование технологии на опытно-промышленный биореактор с рабочим объемом 100 л. Для успешного масштабирования были адаптированы условия перемешивания, подачи сжатого воздуха, параметров РГО-регулятора с учетом различий в массообмене между лабораторным и опытно-промышленным оборудованием. Поддержание коэффициента массообмена (320-340 л/ч) обеспечило сохранение условий культивирования на различных масштабах (Таблица 3).

Таблица 3. — Влажная биомасса и продуктивность штаммов-продуцентов на последний час культивирования в лабораторном и опытно-промышленном

биореакторах

Штамм-продуцент Рабочий объем реактора, л Влажная масса клеток, г/л Удельная продуктивность, мг/г Объемная продуктивность, г/л

BL21\pF1220 3 66,70 ±7,00 37,00±5,47 2,40 ±0,20

100 74,67±2,08 31,70±7,38 2,19±0,29

BL21\pF1223 3 87,90 ±0,85 44,10±1,92 4,68 ±0,20

100 84,89±4,95 46,23±5,16 4,36±0,81

BL21\pF1253 3 103,62 ±7,03 44,06±5,92 4,58 ±0,73

100 108,40±4,10 47,30±2,64 4,72±0,28

BL21\pF1252 3 110,10 ±11,46 61,59±3,11 6,54 ±0,52

100 100,65±3,17 53,26±7,38 5,54±0,53

Продуктивность штаммов-продуцентов BL21\pF1220, BL21\pF1223, BL21\pF1253, BL21\pF1252 составила 2,40 ±0,20, 4,68 ±0,20, 4,58 ±0, 73, 6,54 ±0,52 соответственно. Данные значения продуктивности выше, чем ранее были показаны в исследованиях при получении рекомбинантных пептидов для пищевой промышленности [13, 47-56].

Таким образом, разработанная технология обеспечивает стабильный рост клеток и воспроизводимую экспрессию целевых белков при масштабировании, демонстрируя высокую продуктивность и технологическую надежность, что подтверждает её применимость в промышленном производстве биологически активных веществ.

Разработка и масштабирование технологии очистки биологически активных пептидов

Разработана препаративная технология выделения и очистки гибридных белков пептидов, включающая дезинтеграцию клеточной биомассы, металл-хелатную хроматографию I как стадия захвата, ферментативный гидролиз ULP-1 протеазой, металл-хелатная хроматография II, обращено-фазная ВЭЖХ и лиофильная сушка. Условия гидролиза и стадий хроматографии были оптимизированы для получения продукта, соответствующего требованиям к пищевым ингредиентам по чистоте, подлинности и отсутствию примесей.

Подобраны условия дезинтеграции, обеспечивающие разрушение более 98% клеток. Для этапа гидролиза показано, что полная конверсия гибридного белка достигается в течение одного часа при использовании от 0,04 до 0,16 г телец включения иЪР-1 протеазы на 1 г белка (Рисунок 8). Было показано, что при проведении препаративного протеолиза SUMO-гибридных белков требуется добавление к субстрату мочевины, аргинина и ДТТ до конечных концентраций в растворе 2, 0,5 и 0,0005 моль/л соответственно. Гидролиз проводится при комнатной температуре. Установлен оптимальный диапазон активности фермента, предотвращающий ингибирование при избытке протеазы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Хасаншина Зухра Рамилевна, 2025 год

Литература

1. Wegmuller S., Schmid S. Recombinant peptide production in microbial cells // Current Organic Chemistry. 2014. Vol. 18. № 8. P. 1005-1019.

2. Apostolopoulos V. et al. A global review on short peptides: frontiers and perspectives // Molecules. 2021. Vol. 26. № 2. P. 430.

3. Koutsopoulos S. Peptide applications in biomedicine, biotechnology and bioengineering. Woodhead Publishing, 2017.

4. Zorko M. et al. Expression, purification and structural studies of a short antimicrobial peptide // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2009. Vol. 1788. № 2. P. 314-323.

5. Jin E et al. Expression and characterization of a housefly cecropin gene in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris // Protein expression and purification. 2006. Vol. 49. № 1. P. 39-46.

Изучение влияния условий индукции на продуктивность рекомбинантных штаммов Escherichia coli

Хасаншинв З.Р.*, Корнаков И. А., Буслаева Е.А., Латыпов В.Ф.

RnD центр компании ГЕРОФАРМ

Системы с высоким уровнем экспрессии рекомбинантного белка необходимы для получения продуктов для терапевтического применения. В настоящее время для производства терапевтических белков используется прокариотические, растительные и эукариотические системы экспрессии. Среди прокариотических систем экспрессии Escherichia coli имеет ряд преимуществ: высокая скорость роста, хорошо охарактеризованная генетика, использование простых сред, высокая продуктивность и экономическая эффективность. На эффективность биосинтеза рекомбинантных белков влияют как его физико-химические свойства, выбранный штамм-реципиент и генетическая конструкция, так и условия культивирования: состав питательной среды, условия индукции, режим ферментации. Классическая стратегия получения белка в E.coli включает в себя разделение фаз роста и биосинтеза, для уменьшения метаболической нагрузки на клетку. Разделение осуществляется за счет использования индуцибельного промотора. Известно, что наиболее критическими параметрами процесса культивирования рекомбинантных E.coli с индуцибельными промоторами являются условия индукции: температура культивирования, OD6OO индукции, концентрация индуктора, рН. При этом взаимодействия этих факторов влияют на продуктивность. Использование традиционного подхода к постановке экспериментов не позволяет учесть взаимодействия факторов, влияющих на продуктивность. Следовательно, необходимо использовать статистический метод Design of experiments (DoE), который позволяет изменять несколько факторов за раз, систематизировать обнаружение взаимодействий и построить проектные поля процесса, что важно для фармацевтической разработки.

Таким образом, цель данного исследования оптимизировать условия индукции штамма-продуцента Escherichia coli для увеличения продуктивности.

С использованием классических подходов генной инженерии и молекулярной биологии разработали 4 штамма-продуцента E.coli. Оптимизация условий индукции проводили в колбах с использованием подхода DoE. Валидацию выбранных условий

89

проводили в биореакторах рабочим объемом 3-литра. Для построения моделей использовали программное обеспечения MODDE 12.v1 (Sartorius). Количественное содержание целевого белка определяли методом капиллярного электрофореза.

В результате проведенных работ были получены генетические конструкции, обеспечивающие высокий выход целевых белков. Получены стабильные штаммы-продуценты. Проведена оптимизация процесса индукции. Построены математические модели, описывающие процесс индукции для каждого штамма-продуцента E.coli. Определено, что все исследованные факторы, кроме концентрации индуктора, оказывают влияние на рост и биосинтез.

В результате оптимизации условий индукции продуктивность штаммов-продуцентов увеличена в более чем в 2 раза. Разработанная технология было масштабировано на опытно-промышленные масштабы.

III МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

«Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» г. Санкт-Петербург, 2024

Разработка, характеризации и трансфер банков клеток штаммов-нродуцентов биотехнологических продуктов на примере E.coli

З.Р. Хасаншина'*, Е.А. Буслаева1, Л.М. Кряжевских1

1 Закрытое акционерное общество "Фарм-Холдинт" (RnD ГЕРОФАРМ), Санкт-Петербург, Россия * e-mail: [e-mail]

В области производства биологических препаратов штаммы-продуценты играют решающую роль в разработке жизненно важных методов лечения. В производстве используется двухуровневая система банков клеток: МСВ (Главный банк клеток), получают из PCB (Предварительный банк клеток). Из МСВ получают WCB (Рабочий банк клеток). Выделяют ЕоР СВ (клетки предельного для производства клеточного возраста in vitro), который получают из WCB, выращенных в условиях промышленного производства. PCB получают из первоначального клона, характеризуют и передают на производство, где он проходит входной контроль и из него получают МСВ и WCB в GMP условиях. Характеристика банков включает тестирования для оценки подлинности и качества продукта. Основные рекомендации определены регулирующими органами, таким как Евразийский экономический союз. Международный совет по гармонизации и т.д. Тестирование на чистоту требует определения наличия посторонней микрофлоры, литических и лизогенных бактериофагов. Подлинность генетической конструкции определяется рестрикционным картированием и секвенированисм. Идентичность штамма обозначает проверку происхождения и подтверждение подлинности. Она определяется генотипическнми и фенотипическими характеристиками (окраска по Граму, R-S диссоциации, ссквснирование, оценка ростовых характеристик). Тестирование жизнеспособности и стабильности имеет решающее значение для поддержания стабильности производимых продуктов. Для этого определяют структурную и сегрегационною стабильность пДНК. Изучают жизнеспособность клеток и продуктивность. Оценивается генетическая стабильность (секвенирование и копийность пДНК). Таким образом, наилучший подход - выбор научно-обоснованной методологии к получению и характеризации банков клеток и тщательное документирование шагов на протяжении всего процесса разработки продуцента. Данная работа посвящепа описанию процесса создания, характеризации и трансфера банков клеток на примере Е. coli для производства биотехнологических препаратов.

ТЕЗИСЫ СЕКЦИОННЫХ ДОКЛАДОВ