«Возможности применения секвенирования нового поколения для оценки биомаркеров ответа и резистентности на противоопухолевую терапию» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Сорокина Мария Андреевна

• Сорокина Мария Андреевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Сорокина Мария Андреевна

1.1. Актуальность темы исследования

1.2. Степень разработанности темы исследования

1.3. Цели и задачи

1.4. Научная новизна исследования

1.5. Теоретическая и практическая значимость

1.6. Положения, выносимые на защиту

1.7. Степень достоверности и апробация результатов

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Существующие в клинике омиксные технологии анализа устройства ОМО и поиска биомаркеров

2.2. Конкордантность методов RNA-seq и ИГХ

2.2.1. Применимость NGS методик у пациентов со светлоклеточным почечноклеточным раком

2.3. Новые терапевтические подходы и потенциальные биомаркеры в некоторых видах неходжкинских лимфом

2.3.1. Периферическая Т клеточная лимфома

2.3.1.1. Т-клеточный онтогенез и дифференциация

2.3.1.2. Азацитидин в терапии первой линии у пациентов ПТКЛ. Потенциальные биомаркеры

2.3.1.3. Дувелисиб в комбинации с Ромидепсином или Бортезомибом в терапии рефрактерной или рецидивирующей ПТКЛ. Потенциальные биомаркеры

2.3.1.3.1. Ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы в ПТКЛ: Дувелисиб

2.3.1.3.2. Ингибиторы протеасом в ПТКЛ: Бортезомиб

2.3.1.3.3. Ингибиторы гистондеацетилазы в ПТКЛ: Ромидепсин

2.3.2. Диффузная B крупноклеточная лимфома

2.3.2.1. CART19 в терапии рефрактерной или рецидивирующей ДВККЛ. Потенциальные биомаркеры

2.4. Резюме к обзору литературы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Методы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. КОНКОРДАНТНОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА БИОМАРКЕРОВ С ПОМОЩЬЮ ИММУННОЙ ГИСТОХИМИИ И МЕТОДОМ РНК СЕКВЕНИРОВАНИЯ

4.1.1. Уровень белка PD-L1 у пациентов со скПКР, измеренный методом РНК секвенирования, совпадает с результатом, полученным с помощью иммуногистохимии

4.1.2. Конгруэнтность значений классических биомаркеров, полученных методом ИГХ и РНК секвенирования в солидных неоплазиях

Резюме к разделу

4.2. БИОМАРКЕРЫ ОТВЕТА И РЕЗИСТЕНТНОСТИ НА АЗАЦИТИДИН В КАЧЕСТВЕ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ПЕРЕД CHOP У ПАЦИЕНТОВ С ПТКЛ В КАЧЕСТВЕ ТЕРАПИИ ПЕРВОЙ ЛИНИИ

Резюме к разделу

4.3. БИОМАРКЕРЫ ОТВЕТА И РЕЗИСТЕНТНОСТИ НА ДУВЕЛИСИБ ИЛИ КОМБИНАЦИЮ С БОРТЕЗОМИБОМ ИЛИ РОМИДЕПСИНОМ У ПАЦИЕНТОВ С РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ИЛИ РЕФРАКТЕРНОЙ ПТКЛ

Резюме к разделу

4.4. БИОМАРКЕРЫ ОТВЕТА И РЕЗИСТЕНТНОСТИ НА ТЕРАПИЮ CD19 CAR T КЛЕТКАМИ У ПАЦИЕНТОВ С РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ИЛИ

РЕФРАКТЕРНОЙ ДВККЛ

Анализ экзома

Анализ транскриптома

Реконструкция клональной эволюции

Резюме к разделу

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Возможности применения секвенирования нового поколения для оценки биомаркеров ответа и резистентности на противоопухолевую терапию»»

1.1. Актуальность темы исследования

За последнее десятилетие произошла настоящая революция в подходах к лечению злокачественных новообразований. Во многом это обусловлено бурным развитием иммунотерапии, в частности, благодаря широкому использованию моноклональных антител. Антитела (АТ) - важнейшая составная часть адаптивного иммунного ответа. АТ способствуют распознаванию чужеродных антигенов, а также стимулируют иммунный ответ.

Самым ярким достижением иммунотерапии можно назвать ингибиторы иммунных контрольных точек (immune checkpoint inhibitors - ICI) или чекпойнт-ингибиторы (checkpoint inhibitors). Впервые одобренные FDA в 2014 году, ICI сейчас применяются как первая линия терапии во многих солидных и гематологических онкологиях.

Иммунные контрольные точки могут быть стимулирующими или тормозящими. Опухоли зачастую используют ICI для ускользания от атаки иммунной системы. Современные одобренные ICI блокируют ингибиторные рецепторы контрольных точек. Блокировка сигналов отрицательной обратной связи к клеткам иммунной системы в итоге приводит к усилению противоопухолевого иммунного ответа.

Одним из самых исследуемых лиганд-рецепторных взаимодействий является взаимодействие между трансмембранным белком запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1) и его лигандом (PD-L1) [1]. PD-L1 на поверхности клетки связывается с PD-1 на поверхности иммунной клетки, таким образом, снижая активность иммунных клеток. Применение моноклональных антител, блокирующих PD-L1, помогает Т-клеткам эффективней атаковать опухоль.

Активация адаптивного иммунитета эффективна даже на самых поздних стадиях болезни, однако при данном лечении могут возникать тяжелые побочные эффекты.

Помимо побочных эффектов, до сих пор большой процент пациентов не отвечает на ICI [2]. Для стратификации пациентов на потенциальных ответчиков используются различные шкалы и биомаркеры. В последнее время появляется все больше данных о связи опухолевого микроокружения и ответа на иммунотерапию.

Опухолевое микроокружение (ОМО) играет важнейшую роль в прогрессировании заболевания. ОМО состоит из клеточной и внеклеточной компоненты. Каждая из этих компонент может выполнять как про-, так и противоопухолевую активность [3]. Во внеклеточную компоненту входят матрикс и сигнальные молекулы.

Внеклеточный матрикс (ВМ) отвечает за межклеточное взаимодействие, клеточную адгезию и пролиферацию. ВМ состоит из молекул клеточной адгезии (фибронектин и витронектин), структурных белков (коллаген и эластин), различных гликопротеинов (ламинин) и гликозаминогликанов. ВМ продуцируется как самой опухолью, так и окружающей стромой. В процессе канцерогенеза описано ремоделирование ВМ, которое приводит, в том числе, к высвобождению биологически активных молекул, таких как VEGF, PDGF и др [4]. Матриксная инвазия является важным условием прогрессирования опухоли.

Клеточную компоненту опухолевой ниши составляют миофибробласты, фибробласты, нейроэндокринные клетки, жировые клетки, клетки воспалительного инфильтрата, а также кровеносные и лимфатические сосуды. Интересно заметить, что описано противоположное влияние фиброзного типа ОМО на прогноз пациентов с солидными неоплазиями и гематоонкологическими заболеваниями. По данным анализа 8024 пациентов с солидными опухолями при наличии большого количества стромы в ОМО общая выживаемость пациентов уменьшается [3], в то время как у пациентов с диффузной B крупноклеточной лимфомой высокая пропорция стромальных элементов, наоборот, была предиктором лучшего исхода.

Если анализировать ОМО с точки зрения наличия и расположения иммунных клеток, то классическим считается подход, выделяющий 3 типа ОМО (Рис.1):

1) Исключенный

2) Инфильтрированный

3) С формированием третичных лимфоидных структур (ТЛС)

а 1пйИга1ес1-ехс1ис1ес1 Ь [пйИгаййнпАатеа с 1лМга1ес1-П_8

Рисунок 1 - Типы инфильтрации опухолей иммунными клетками [5]

Для получения разнообразной информации о ОМО новые исследования сосредотачиваются не только на его составе и молекулярных особенностях, но и на пространственной организация компонентов в ОМО, т.е. архитектуре. На данный момент описаны цитокины, которые привлекают иммунные клетки в ОМО (цитокины-атрактанты), а также цитокины эксклюзии, которые, наоборот, препятствуют иммунной инфильтрации опухоли. Цитокины - это небольшие растворимые белки, выделяемые злокачественными новообразованиями, стромальными и иммунными клетками в ОМО. При взаимодействии со своими рецепторами запускается внутриклеточный сигнальный путь, который может регулировать рост, апоптоз, активацию и дифференцировку клеток-мишеней [6]. Зависящие от расстояния иммунные взаимодействия, такие как паракринные, аутокринные или клеточные контакты также подтверждают, что пространственные отношения имеют важное значение в исследование ОМО. Пространственная архитектура опухоли и экспрессируемые цитокины могут стать полноценным

биомаркером ответа на иммунотерапию [7] [8].

Во всех областях онкологии был достигнут значительный научный прогресс благодаря открытию новых технологий, а также усовершенствованию in vitro и in vivo моделей [9]. Геномика и транскриптомика опухоли играют ключевую роль в понимании причин эффективности и резистентности разных классов противоопухолевых препаратов. Всесторонняя молекулярная характеристика опухоли - это один из способов поиска перспективных биомаркеров ответа на терапию. Применение геномных и транскриптомных методов предлагает дополнительную возможность для анализа гетерогенности опухолей и поиска новых биомаркеров, которые могут быть использованы для разработки новых терапевтических стратегий, что поможет увеличить общую (OS) и беспрогрессивную (PFS) выживаемость пациентов. Секвенирование всего экзома (WES) и секвенирование РНК (RNA-seq) наряду с классической иммуногистохимией позволяют максимально всесторонне проанализировать как опухоль, так и ее микроокружение.

1.2. Степень разработанности темы исследования

В настоящее время высока потребность в валидации новых эффективных высокотехнологических методик секвенирования и поиске новых биомаркеров для оптимизации лечения онкологических заболеваний. На данный момент молекулярно-генетические методы широко применяются в онкологии. Однако, несмотря на их растущее признание, зачастую геномная характеристика опухоли сводится к использованию таргетных панелей, содержащих только ограниченное количество генов, которые фиксируют лишь малую часть онкогенных изменений.

В ряде работ акцентируется внимание на перспективности применения полноэкзомного и полнотранскриптомного секвенирования опухолевых биопсий для всеобъемлющей характеристики опухоли. Например, у пациентов с аденокарциномой легкого WES превосходил таргетное секвенирование в оценке

TMB как биомаркера для ICI [10]. Сравнивалась успешность детекции таргетируемых альтераций с помощью стандартной генетической панели и WES, в ходе которого обнаружено, что с помощью WES удается найти в 3.4 раза больше генетических событий, важных для правильного выбора лечения. В исследовании показана клиническая полезность использования комбинированных методик для лучшего понимания молекулярных детерминант ответа на иммунотерапию [11]. Тем не менее, практически все авторы отмечают, что ошибки выравнивания, недостаточная чувствительность и высокая частота ложноположительных результатов при недостаточном покрытии создают определенные затруднения для реального широкого применения WES.

В ходе множества ретроспективных исследований показано, что ОМО стратифицирует ответ на терапию и является независимым прогностическим маркером [12-15]. Bagaev и соавторы на основе транскриптомного анализа >10 000 онкологических пациентов выявили четыре различных подтипа ОМО, сохраняющихся при 20 различных видах рака [3]. Подтипы ОМО коррелировали с ответом пациентов на иммунотерапию при различных видах рака, причем пациенты, обладающие иммуноблагоприятными подтипами ОМО, получали наибольшую пользу от иммунотерапии. Таким образом, подтипы ОМО действуют как универсальный биомаркер для иммунотерапии при многих видах рака благодаря интеграции компонентов злокачественной опухоли и микроокружения. В связи с этим валидация методов секвенирования для их последующего использования в реальной клинической практике и поиск новых биомаркеров ответа на новые виды терапии в онкологии имеет особую важность.

1.3. Цели и задачи

Цель исследования - Изучить возможность применения секвенирования нового поколения для оценки биомаркеров ответа и резистентности на новые виды противоопухолевой терапии.

Задачи научного исследования

1. Установить конкордантность измерения ключевых клинических биомаркеров с помощью ИГХ и RNA-seq с использованием образцов солидных неоплазий.

2. Определить связь между экспрессией PD-L1 и различными типами микроокружения опухоли с использованием образцов скПКР.

3. Методами RRBS, WES и RNA-seq провести поиск биомаркеров ответа и резистентности у пациентов с рефрактерной ПТКЛ на терапию азацитидин + CHOP.

4. Провести поиск биомаркеров ответа и резистентности на терапию дувелисибом или комбинацией с ромидепсином/бортезомибом у пациентов с рецидивирующей или рефрактерной ПТКЛ с помощью методов WES и RNA-seq.

5. Провести поиск биомаркеров ответа и резистентности на терапию CART19 у пациентов с рефрактерной ДВККЛ с помощью методов WES и RNA-seq.

1.4. Научная новизна исследования

Впервые методом RNA-seq определены оптимальные пороговые значения экспрессии для генов ESR1 (4 TPM), ERBB2 (8 TPM), PGR (2 TPM), MKI67 (4 TPM) и CD274 (2.5 TPM), конкордантные соответствующим результатам ИГХ у пациентов с солидными карциномами.

Впервые на основании данных WES проведен биомаркерный анализ у пациентов с ПТКЛ, получавших азацитидин в качестве хемосенсибилизации перед CHOP в рамках терапии первой линии, в ходе которого обнаружено, что мутации TET2 достоверно связаны с ответом на азацитидин, а мутации DNMT3A - с резистентностью. Методом RNA-seq показана повышенная экспрессия генов, связанных с апоптозом и воспалением на фоне приема азацитидина.

Впервые на основании данных WES и RNA-seq проведен биомаркерный анализ у пациентов, получавших дувелисиб или комбинацию с ромидепсином или бортезомибом для терапии рефрактерной или рецидивирующей ПТКЛ, в ходе

которого обнаружена связь мутаций TET2, сигнатуры активности PI3K сигнального пути и сигнатуры Tfh с ответом на терапию.

Впервые выявлена ассоциация амплификации PIK3CA и мутации CREBBP с беспрогрессивной выживаемостью у пациентов с рефрактерной и рецидивирующей ДВККЛ, получавших терапию CD19 CAR T клетками, и доказана возможность использования типов микроокружения Kotlov и соавторов для прогноза выживаемости при терапии CART19.

1.5. Теоретическая и практическая значимость

Практическое и теоретическое значение представляет изучение роли микроокружения опухоли, нарушений копийности и детекции мутаций в прогрессировании заболевания, а также ответе на иммунотерапию. Выделенные типы микроокружения и обнаруженные генетические события могут помочь в стратификации риска побочных эффектов иммунотерапии, а также более точно определить потенциальных ответчиков. Разработанные оптимальные пороговые значения экспрессии для ключевых биомаркеров методом RNA-seq помогут внедрить методы транскриптомики в ежедневную клиническую практику.

1.6. Положения, выносимые на защиту

Положение 1: RNA-seq может быть использовано для оценки уровня экспрессии ключевых клинических биомаркеров и предсказания ответа на иммунотерапию. В когорте пациентов с солидными карциномами методом RNA-seq определены оптимальные пороговые значения экспрессии для генов ESR1 (4 TPM), ERBB2 (8 TPM), PGR (2 TPM), MKI67 (4 TPM) и CD274 (2.5 TPM), которые согласуются с соответствующими результатами позитивности по ИГХ. Анализ экспрессии белка PD-L1 с помощью RNA-seq и ИГХ в когорте пациентов со скПКР также показал значительную конкордантность (p<0.001). Пациенты с более высокой экспрессией

PD-L1, измеренной либо с помощью RNA-seq, либо с помощью ИГХ, коррелируют с ответом на ICI.

Положение 2: На основанных сигнатур экспрессии генов у пациентов со скПКР обнаружено два типа микроокружения: инфильтрированный (с высокой инфильтрацией лимфоцитами) и исключенный, состоящий преимущественно из злокачественных клеток. В образцах биопсий скПКР с иммунно обогащенным типом ОМО по данным RNA-seq выявлен более высокий процент опухолей с детектируемым белком PD-L1 по данным ИГХ (>1% для опухолевых клеток, p=0.02; >1% для иммунных клеток, p <0.001).

Положение 3: В когорте пациентов с ранее нелеченной ПТКЛ (с превалированием Tfh подтипа), принимающих азацитидин в качестве хемосенсибилизации перед CHOP, обнаружено, что мутации TET2 достоверно связаны с полным ответом на терапию (p=0.007), благоприятными PFS (p=0.004) и OS (p=0.015), а мутации DNMT3A связаны с неблагоприятными PFS (p=0.016). На фоне лечения активируются гены, связанные с апоптозом (p<0.01) и воспалением (p<0.01), а также наблюдается тренд снижения пролиферации и процента Tfh-клеток по данным деконволюции.

Положение 4: У пациентов с рефрактерной и рецидивирующей ПТКЛ мутации TET2 были связаны с ответом на дувелисиб или комбинацию (p = 0.0036). Было установлено более высокое содержание В-клеток в исходных биопсиях у ответчиков по сравнению с неответчиками (p=0.008). Уровни экспрессии сигнатур PI3K сигнального пути (p=0.08) и T фолликулярных хелперов до начала терапии были выше у ответчиков (p=0.08 и p<0.001, соответственно).

Положение 5: У пациентов с рефрактерной и рецидивирующей ДВККЛ, получавших терапию CART19 клетками, обнаружено 2 биомаркера беспрогрессивной выживаемости: амплификация PIK3CA (p=0.04) и мутация CREBBP (p=0.03). Пациенты с благоприятными подтипами (GCB и стромальным) ОМО продемонстрировали более высокую общую выживаемость по сравнению с

неблагоприятными (инфильтрированными и исключенными) подтипами (p=0.02). При анализе транскриптома отмечена повышенная экспрессия сигнатуры MHCII и сигнатуры центроцитоподобных клеток, которые коррелировали с ответом на CART19 в подтипе GCB-ДВККЛ (p=0.03).

1.7. Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов всех исследований подтверждается адекватными методами статистического анализа и валидацией части результатов на публичных когортах. Полученные данные свидетельствуют о достижении цели исследования и решении поставленных задач.

Результаты диссертационной работы доложены на международной научной конференции «American Association for Cancer Research» (Филадельфия, 2021), 63-й международной научной конференции «American Society of Hematology» (Атланта, 2021), 64-й международной научной конференции «American Society of Hematology» (Новый Орлеан, 2022), VIII Всероссийской научной конференции молодых ученых «Медико-биологические, клинические и социальные вопросы здоровья и патологии человека» (Иваново, 2022, 2023). Результаты исследования были представлены на заседании кафедры фармакологии ФГБОУ ВО ИвГМА Минздрава России 30 мая 2023 года.

Личный вклад автора состоит в выполнении аналитической части диссертационного исследования, автором проведена обработка и интерпретация полученных данных. При участии автора также были подготовлены публикации по результатам диссертационной работы.

Диссертационная работа выполнена согласно плану научно-исследовательской работы ФГБОУ ВО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава России.

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ, из которых 3 в списке журналов, включенных в международную базу данных SCOPUS и 2 в списке журналов рекомендуемых ВАК Минобрнауки России по специальности 3.3.6. Фармакология, клиническая фармакология.

Диссертационная работа изложена на 138 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех разделов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 175 источников. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 46 рисунками.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В области исследования и лечения рака концепция прецизионной медицины стратегии профилактики и лечения, учитывающие индивидуальные особенности человека, основываются на разработке достоверных биомаркеров, выявляющих ключевые аберрантные пути, на которые потенциально могут быть направлены цитотоксические, таргетные, иммунные или клеточные методы лечения. Несмотря на то, что биомаркеры, такие как простат-специфический антиген, были известны и использовались на протяжении десятилетий для принятия прогностических и терапевтических решений, недавняя революция в молекулярной биологии, вызванная ростом высокопроизводительного секвенирования, привела к экспоненциальному росту попыток измерения и обнаружения аберрантных сигнальных путей на молекулярном уровне [16].

С момента зарождения геномики в конце 1980-х годов значительное внимание уделялось стоимости секвенирования одного генома человека. Например, Национальный институт исследования генома человека в течение многих лет тщательно отслеживал затраты на геном в финансируемых им "центрах секвенирования генома" (Рис. 2)

https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Sequencing-Human-Genome-cost. С ростом масштабов исследований в области генетики человека и увеличением числа клинических применений секвенирования генома еще большее внимание уделяется пониманию основных затрат на создание последовательности генома человека. Тем не менее, существует большой разрыв между многочисленными сообщениями о биомаркерах и их клиническим внедрением.

Рисунок 2 - Стоимость секвенирования генома человека во времени

В связи с большей доступностью высокопроизводительных технологий геномной характеристики, надежные и хорошо валидированные биомаркеры рака становятся все более необходимыми. Например, более 90% онкологических препаратов, которые начинают клиническую разработку, не получают одобрения на рынке из-за того, что клинические испытания не смогли продемонстрировать терапевтический эффект, что приводит к дорогостоящей и медленной разработке лекарств от рака [17]. По признанию Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), разумное использование биомаркеров должно сыграть важную роль в минимизации риска неудачи клинических испытаний путем обогащения популяций участников испытаний конкретными молекулярными подтипами, лучше реагирующими на тестируемые методы лечения.

Несмотря на достигнутый значительный прогресс, существует острая необходимость в открытии и разработке новых эффективных биомаркеров в области онкологии. На Рисунке 3 представлены основные этапы разработки биомаркеров: открытие, разработка анализа/аналитическая проверка, клиническая проверка, клиническая польза и, наконец, клиническое внедрение [18-20].

Открытие

Аналитическая валидация

Клиническая валидаЦИЙ

Клиническая польза

Применениен клинике

Обнаружение потенциальных преднктивных и npoiноетических биомаркеров

-Выбор методик обнаружения -Анализ воспроизводимо етп методик

Анализ работы биомаркера н клинике

Анализ реального улучшения здоровья пациентов при не пользовании биомаркера

Анализ интеграции биомаркера I;

реальную клиническую практику

Рисунок 3 - Этапы поиска новых биомаркеров для клинических испытаний, адаптировано из [18-20]

Однако большинство имеющихся современных методик поиска новых биомаркеров не валидированы, протоколы исследований не согласованы, отсутствует единое регулирование [16]. Эти недостатки, по-видимому, являются основными причинами разрыва между широким спектром биомаркеров в области онкологии, которые оказались эффективными в отдельных исследованиях, и относительно небольшим количеством биомаркеров, готовых к внедрению в клинику. Следовательно, наиболее сложной задачей в краткосрочной перспективе может стать не поиск новых молекул и путей, а валидация роли существующих методов, чтобы сократить разрыв между лабораторными и клиническими исследованиями [21].

2.1. Существующие в клинике омиксные технологии анализа устройства ОМО и поиска биомаркеров

В основе омиксных технологий лежит набор методов от секвенирования нуклеиновых кислот, использование микрочипов и анализа модификаций гистонов до жидкостной хроматографии и масс спектрометрии. Можно выделить ряд подразделов, таких как геномика, эпигеномика, транскриптомика, протеомика, интерактомика и метаболомика.

Омиксные данные, первоначально использовавшиеся для проведения анализа, ориентированного непосредственно на опухоль (tumor intrinsic features), теперь используются для извлечения дополнительных характеристик, описывающих клеточную и молекулярную гетерогенность ОМО (tumor extrinsic features).

Данные RNA-seq могут использоваться отдельно или в сочетании с данными секвенирования полного экзома или генома для предсказания специфических для пациента раковых неоантигенов, возникающих в результате соматических мутаций, нарушений копийности, слияний генов или альтернативно сплайсированных транскриптов. Предполагаемые неоантигены, которые могут вызвать противораковый ответ, могут быть предсказаны вычислительным путем с помощью трех основных этапов: (1) предсказание пептидов, возникающих в результате экспрессии трансформированных генов; (2) реконструкция аллелей человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) пациентов; (3) идентификация пептидов, связывающихся с HLA-аллелями пациентов. В июле 2017 года два клинических исследования продемонстрировали успешное лечение прогрессирующей меланомы на основе персонализированных неоантигенов [22,23]. Однако, потенциал этих стратегий все еще ограничен из-за сложности прогнозирования иммуногенности неоантигена in silico.

Транскриптомные данные также могут быть использованы для количественной оценки различных типов клеток ОМО с помощью анализа обогащения набора генов (GSEA) или деконволюции. В то время как GSEA может оценить только обогащение типов клеток в образце, методы деконволюции позволяют количественно оценить относительные фракции клеток, рассматривая профиль экспрессии опухолей как "конволюцию" клеточно-специфических сигнатур

[3].

RNA-seq дает разрешение на уровне одного основания, что позволяет проводить анализ на уровне последовательности, например, выявлять слитые транскрипты, что невозможно на основе данных микрочипов.

Традиционные методы "массового" RNA-seq анализируют смесь всех клеток, частично усредняя различия в транскриптомах, специфичных для каждого типа клеток. В отличие от этого, RNA-seq единичных клеток (scRNA-seq) профилирует картину экспрессии генов каждой отдельной клетки и расшифровывает ее межклеточные сигнальные сети. Такая непредвзятая характеристика дает четкое представление обо всей экосистеме опухоли и взаимодействии клеток с клетками посредством лиганд-рецепторной сигнализации, однако является крайне дорогой методикой, что осложняет ее реальное применение в клинической практике. Одной из важных проблем в анализе данных scRNA-seq, которая приводит к возникновению всех этих проблем, является явление, называемое "dropout" или "выпадение", когда ген наблюдается на низком или умеренном уровне экспрессии в одной клетке, но не обнаруживается в другой клетке того же типа клеток [24]. Эти выпадения происходят из-за малого количества мРНК в отдельных клетках и неэффективного захвата мРНК, а также из-за стохастичности экспрессии мРНК. В результате выпадения данные scRNA-seq часто оказываются очень разрозненными. Чрезмерное количество нулевых значений приводит к тому, что данные занижаются, захватывая лишь небольшую часть транскриптома каждой клетки.

Метилирование цитозина в ДНК - это эпигенетическая модификация, участвующая в регуляции экспрессии генов. Метилирование ДНК происходит преимущественно в контексте CpG, которые более многочисленны в отдельных регионах генома. RRBS - это мощный подход к геномному анализу метилирования ДНК, который сочетает в себе обработку рестрикционными ферментами и бисульфитное секвенирование для обогащения CpG-плотной фракции генома. Такое сочетание делает RRBS более эффективным в использовании образцов и идеальной платформой для пилотных исследований и клинических приложений. RRBS секвенирует только фрагменты, относящиеся к CpG-богатым регионам, что значительно снижает стоимость по сравнению с бисульфитным секвенированием всего генома. RRBS является очень экономически эффективным, учитывая, что

секвенированию подвергается около 1-5% генома, охватывая около 12% геномных CpG-сайтов и около 84% CpG-островков в промоторах [25].

Отдельного внимания заслуживают бурно развивающиеся методы мультиплексной иммуногистохимии. В отличие от обычной ИГХ, которая позволяет маркировать только один единственный маркер в образце ткани, мультиплексная ИГХ способна обнаружить множество маркеров в одном образце ткани, предоставляя при этом полную информацию о составе и пространственном расположении клеток [26].

2.2. Конкордантность методов RNA-seq и ИГХ

ИГХ и молекулярные тесты играют важную роль в диагностике и лечении рака. Однако именно ИГХ является золотым стандартом для прогнозирования терапевтического ответа на эндокринную, таргетную и иммунную терапию [27-31]. Кроме того, эти анализы на основе тканей FFPE в настоящее время используются в клинической практике для классификации или прогнозирования риска рецидива у пациентов, страдающих различными типами опухолей. Хотя ИГХ-оценка ER, PR, HER2, Ki67 и PD-L1 в опухолевых образцах стала возможным биомаркером, ее потенциальное использование ставит множество вопросов и проблем как перед онкологами, так и перед патологоанатомами [32-35]. Для измерения уровня белка используются различные клоны антител, платформы окрашивания и системы оценки ИГХ, а также клинические критерии отсечения. Например, в образцах немелкоклеточного рака легкого патоморфологи могут оценить экспрессию PD-L1 по проценту положительных опухолевых клеток клона SP263, при раке молочной железы - по комбинированным положительным показателям (combined positive score, CPS) клона 22C3, а при уротелиальной карциноме необходимо подсчитать иммунные клетки клона SP142 в микроокружении опухоли [31]. Онкологи должны

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сорокина Мария Андреевна, 2023 год

и 60% -

% -С 40% -

а

у 20% ■

о

0%

\ ЦТ—ц

* | + > ЦГ-

р-уэ1ие = 0.003

100%

й 80%

П 5

I 60% ■

в =

| 40% I

20%

Ч

р-уа1ие = 0,03

20 40

Месяцы

60

0%

| Люмииальный А

\ .'Номинальный В | НЕЮ позитивный I Тройной негативный

20 40

Месяцы

60

Рисунок 20 - Кривые общей выживаемости Каплана-Мейера 237 пациентов с РМЖ (TCGA когорта РМЖ, стадии III и IV) по рецепторному статусу ER/PR/HER2, измеренному методом ИГХ (слева) и методом RNA-seq (справа)

Тенденции выживаемости аналогичны для обоих методов для когорт с положительным по гормональным рецепторам (ER и PR) и HER2-отрицательным (HR+HER2-) статусом (люминальный А подтип), положительным по гормональным рецепторам (ER и PR) с HER2-положительным (HR+HER2+) статусом (люминальный В подтип), отрицательным по гормональным рецепторам с HER2-положительным (HR-HER2+) (HER2 позитивный подтип) и трижды негативным РМЖ (ТКВС, базальный подтип). Предположительно, полученные пороговые значения RNA-seq улавливают биологическую передачу сигналов.

Продемонстрирована важная корреляция опухолевых клеток Кь67+ и экспрессии МК167 согласно RNA-seq при РМЖ и других солидных опухолях (рисунок 21).

Рисунок 21 - Значение порога позитивности И67 экспрессии методом RNA-seq (4 ТРМ), определенная на лабораторной когорте РМЖ (слева) и валидированная на TCGA когорте РМЖ (справа)

Статус пролиферации в солидных карциномах можно оценить по экспрессии MKI67 с помощью RNA-seq так же, как и с помощью ИГХ. Пороговые значения для положительного результата на Ki-67 по ИГХ приведены в рекомендациях St. Gallen 2015 г. и международной рабочей группы по Ki-67 при раке молочной железы [27].

В случаях карцином молочной железы статус высокой пролиферации Ki-67 по ИГХ присваивался при превышении предела в 20% положительных опухолевых ядер. Пороговое значение Ki-67, равное 20%, используется для стратификации пациентов на группы низкого или высокого риска рецидива и смерти от ER+ рака молочной железы, а также для определения приемлемости системной терапии [28,146,147]. Значение Ki-67 по ИГХ определяет индивидуальную стратегию для пациентов с люминальными А и B молекулярными подтипами опухоли молочной железы.

В нашей работе показана высокая корреляция результатов экспрессии гена MKI67 и его продукта Ki67, полученных методами RNA-seq и ИГХ (г=0.8, p=2.7*10-14; Рис 22а). Образцы рака молочной железы из TCGA были

стратифицированы в соответствии с пороговым значением MKI67, полученным на внутренней лабораторной когорте с помощью RNA-seq. Безрецидивный интервал (disease free interval, DFI) для стадий I, II и III сравнивается на основе пороговых значений по RNA-seq. Группа с высоким уровнем Ki-67 характеризуется значительно худшими результатами по сравнению с группой с низким уровнем Ki-67 (рисунок 22б).

Рисунок 22 - а. Корреляция Спирмена методов ИГХ и RNA-seq при измерении маркера Ю67 в солидных опухолях (лабораторная когорта). б. Кривые общей выживаемости Каплана-Мейера 603 пациентов с РМЖ (TCGA когорта РМЖ, стадии I, II, III) по И67 статусу, измеренному методом РНК-сек

Также было показано, что окрашивание опухолевых клеток PD-L1 достоверно коррелирует с RNA-seq CD274 (r=0.56, p=4.5*10-7; Рис 23а). Для сравнения данных ИГХ с данными RNA-seq для лабораторной когорты мы использовали комбинированный показатель позитивности (CPS) PD-L1 >10 (рисунок 23б).

а

PD-L1

б

N=71

6

ь

§ *

О 1-1-1-1-г

О 20 40 60 80

| РМЖ

[j Другие солидные опухоли

2.5

CPS <10,11ГХ ■ CPS >10.ИГХ

Опухолевые клетки, ИГХ

<10 >10

CPS, ИГХ

Рисунок 23 - а. Корреляция Спирмена методов ИГХ и RNA-seq при измерении маркера PD-L1 в солидных опухолях (лабораторная когорта). б. Значение порога позитивности PD-L1 экспрессии методом RNA-seq (2.5 TPM), определенная на лабораторной когорте солидных опухолей (N=71).

Резюме к разделу 4.1

На сегодняшний момент в клинических рекомендации Минздрава РФ, FDA и ESMO не упомянут метод определения белков-биомаркеров с помощью РНК секвенирования. Тем не менее, в связи с удешевлением и более широким использованием молекулярно-генетических методов диагностики, встает вопрос о внедрении таких подходов в повседневную клиническую практику. Также, для многих видов солидных неоплазий и лимфом в практических рекомендациях отсутствует четкое указание на прогностическую или предиктивную ценность уже известных биомаркеров, измеренных классической методикой ИГХ. Во многом это связано с ограничениями метода ИГХ, а также нехваткой исследований, которые бы четко указывали на связь данных биомаркеров с ответом на лечение.

В нашей диссертационной работе сравнивалась чувствительность и конкордантность методов RNA-seq и ИГХ для обнаружения ключевых клинических

биомаркеров (PD-L1, Ki67, Her2, ER, PR) в публичных и внутренних когортах пациентов с солидными неоплазиями. Значения мРНК PD-L1, Ki67, Her2, ER, PR и анализ ИГХ показали существенное совпадение. Также было показано, что пациенты со скПКР с более высокой экспрессией PD-L1, измеренной с помощью RNA-seq или ИГХ, коррелируют с ответом на терапию блокаторами иммунных контрольных точек.

Кроме того, с помощью метода RNA-seq было выявлено 2 типа ОМО: инфильтрированный (более высокая положительная реакция на PD-L1) и исключенный (более низкая положительная реакция на PD-L1) у пациентов со скПКР, что также достоверно коррелировало со степенью иммунной инфильтрации по данными ИГХ. С помощью методов транскриптомики представляется возможным более глубокий анализ гетерогенности опухолей и поиска новых биомаркеров. Секвенирование РНК наряду с классической иммуногистохимией позволяют максимально всесторонне проанализировать как опухоль, так и ее микроокружение, которое, в свою очередь, может быть самостоятельным как прогностическим, так и предиктивным биомаркером.

Таким образом, корреляция значений экспрессии белка, полученных с помощью методов RNA-seq и ИГХ, обеспечивает дополнительную ценность в определении биомаркеров, что может способствовать актуализации персонализированной терапии для онкологических больных. Будущие проспективные исследования будут иметь решающее значение для дальнейшей проверки конкордантности измерений биомаркеров с помощью RNA-seq в клинической практике.

Представленные в данной главе результаты опубликованы в работах:

1. Sorokina M., Stupichev D., Lyu Y., Ramachandran A., Miheecheva N., Brown J.,

Nomie K., Postovalova E., Bagaev A., Tsiper M., Hsieh J. Diagnostic Utility of

RNA-Seq for Evaluation of PD-L1 Expression in Clear Cell Renal Cell Carcinoma //Clinical Genitourinary Cancer. - 2021. - V. 19. - №. 6. - P. E374-e381.

2. Miheecheva N., Sorokina М., Ramachandran A., Lyu Y., Stupichev D., Bagaev A., Postovalova E., Nomie K., Frenkel F; Tsiper M; Fowler N; Ataullakhanov R; Hsieh J. Evaluating the clinical utility of RNA-seq-based PD-L1 expression and cellular deconvolution as alternatives to conventional immunohistochemistry in clear cell renal cell carcinoma //Cancer Research. - 2021. - V. 81. - №. 13_Supplement. - P. 161-161.

4.2. БИОМАРКЕРЫ ОТВЕТА И РЕЗИСТЕНТНОСТИ НА АЗАЦИТИДИН В КАЧЕСТВЕ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ПЕРЕД CHOP У ПАЦИЕНТОВ С ПТКЛ В КАЧЕСТВЕ ТЕРАПИИ ПЕРВОЙ ЛИНИИ

Как обсуждалось в литературном обзоре, праймирование пероральным азацитидином в сочетании с CHOP в качестве начальной терапии может привести к хемосенсибилизации и улучшению ответа у пациентов с ПТКЛ. В текущей главе приводятся результаты поискового анализа биомаркеров ответа и резистентности на азацитидин в комбинации с CHOP в качестве начальной терапии ПТКЛ в рамках многоцентрового исследовании фазы 2 (ClinicalTrials.gov - NCT03542266).

Всего в исследование был включен 21 пациент с ранее нелеченной ПТКЛ, которые были зарегистрированы в 4 центрах с июня 2018 г. по март 2020 г. В Таблице 4 приведена клинико-демографическая характеристика когорты. Таблица 4 - Клинико-демографическая характеристика пациентов

Характеристика Количество пациентов Процент

Размер когорты 21 100%

Пол

Мужской 13 62%

Женский 8 38%

Возраст, годы

Медиана 66

Разброс 22-77

ECOG шкала 0-1 >1

Ann Arbor классификация

III-IV стадия 19 90%

ЛДГ Норма Повышение Вовлечение костного мозга Есть

Нет

Нет данных ПТКЛ подтипы ПТКЛ-TFH ПТКЛ-NOS ТЛЛВ

IPI категория риска 0-1 2 3

4-5

CD30 экспрессия

Позитивная (> 5%) 5 24%

Негативная (<5%) 16 76%

На момент включения в исследование у 17 пациентов (81%) была диагностирована нодальная ПТКЛ-Tfh, а именно АИТЛ, у 3 — ПТКЛ неуточненная, у 1 — ТКЛВ. Медианный возраст составил 66 лет (диапазон 22-77 лет), а соотношение М:Ж — 1.6:1. У девятнадцати субъектов (90%) диагностировано

13 8

62% 38%

11 10

52% 48%

13 1

33%

62% 5%

7

17 3 1

81% 14% 5%

5 7 3

6

24% 33% 14% 29%

заболевание III/IV стадии, 10 (48%) имели повышенный уровень ЛДГ, 7 (33%) имели поражение костного мозга и у 9 (43%) значения международного прогностического индекса (IPI) составили 3-5.

Один пациент с неуточненной ПТКЛ отозвал согласие до завершения первого цикла лечения из-за низкого комплаенса. Из 20 пациентов, подлежащих оценке, 2 пациента прекратили терапию после промежуточной оценки после трех циклов исследуемого лечения из-за прогрессирования заболевания у пациента с АИТЛ и из-за стронгилоидозной гиперинфекции у пациента с ТКЛВ, достигшего промежуточного полного метаболического ответа. Восемнадцать пациентов завершили исследуемое лечение. Из 15 пациентов, достигших ремиссии, у 10 далее проводилась трансплантация стволовых клеток (ТСК) (9 ауто-ТСК и 1 с алло-ТСК). У шести пациентов наблюдалось прогрессирование заболевания после ремиссии, в том числе у двух пациентов с АИТЛ, у которых развилась впоследствии ДВККЛ. У одного спрогрессировавшего пациента развилось миелопролиферативное новообразование с мутацией JAK2 V617F.

Оценка безопасности применения азацитиндина в качестве прекондиционирования перед CHOP у пациентов с ПТКЛ

Как видно в Таблице 5 лечение в целом хорошо переносилось с ожидаемыми побочными эффектами.

Таблица 5 - Побочные эффекты терапии

Токсичность* Любой степени N % Степень >3 N %

Со стороны системы кроветворения

нейтропения 15 71.4% 15 71.4%

анемия 11 52.4% 3 14.3%

тромбоцитопения 11 52.4% 2 9.5%

фебрильная нейтропения 3 14.3% 3 14.3%

Инфекции

Инфекция мочевыводящих путей 4 19.0% 00

Стоматит 4 19.0% 00

целлюлит 3 14.3% 1 4.8%

пневмония 1 4.8% 1 4.8%

C. diff ассоциированная диарея 1 4.8% 1 4.8%

Стронгилоидозная гиперинфекция 1 4.8% 1 4.8%

Influenza A 1 4.8% 1 4.8%

COVID-19 пневмония 1 4.8% 1 4.8%

Другие

Констипация 18 85.7% 00

Тошнота 15 71.4% 00

Усталость 13 61.9%% 3 14.3%

Частый жидкий стул 11 52.4% 1 4.8%

Рвота 11 52.4% 1 4.8%

Боли в животе 11 52.4% 00

Уменьшение массы тела 6 28.6% 1 4.8%

Головокружение 6 28.6% 0 0

Сыпь 5 23.8% 1 4.8%

Нейропатия 5 23.8% 1 4.8%

Алопеция 5 23.8% 00

Гипонатриемия 4 19.0% 3 14.3%

Артериальная гипертензия 4 19.0% 00

Гипергликемия 4 19.0% 00

Дисгевзия 4 19.0% 00

ГЭРБ 4 19.0% 00

Артралгия 4 19.0% 00

Миалгия 4 19.0% 00

Гипотония 4 19.0% 00

Кашель 4 19.0% 00

Зуд 4 19.0% 00

Повышение АЛТ 3 14.3% 1 4.8%

Головная боль 3 14.3% 1 4.8%

Гипоальбуминемия 3 14.3% 1 4.8%

Гипокальциемия 3 14.3% 1 4.8%

Лихорадка 3 14.3% 00

Повышение АСТ 3 14.3% 00

*: Негематологические нежелательные явления, возникшие более чем у 5% пациентов.

Возникающая при лечении гематологическая токсичность 3-4 степени включала нейтропению (71%), тромбоцитопению (10%) и анемию (14%) с фебрильной нейтропенией (14%). Негематологическая токсичность 3-4 степени включала утомляемость (14%), гипонатриемию (14%), по 5% пришлось на анорексию, диарею, повышение уровня АЛТ, гипоальбуминемию, гипокальциемию, головную боль, невропатию, сыпь и рвоту. Были зарегистрированы и пролечены инфекции 3 степени, включая по одному случаю (5%) целлюлита, пневмонии, гриппа A, COVID-19, C.diff и стронгилоидозной гиперинфекции. В рамках проведенного клинического испытания не было зафиксировано смертности, связанной с лечением. Химиотерапия CHOP проводилась в стандартной дозе без модификации для всех пациентов. Трем субъектам потребовалось измененить дозу перорального азацитидина с 300 мг до 200 мг из-за сыпи 3 степени у 1 субъекта и истощения 3 степени у 2 субъектов.

Оценка эффективности применения азацитиндина в качестве прекондиционирования перед CHOP у пациентов с ПТКЛ

Все ответы представляли собой полные ремиссии в конце лечения, с ORR и CR на уровне 75% для всех оцениваемых 20 субъектов и 88% для 17 субъектов с подтипом ПТКЛ-Tfh (таблица 6).

Таблица 6 - Эффективность праймирования азацитидином

Ответ ПТ КЛ (N=20) ПТКЛ -1 rfh (N=17)

N % N %

Общий ответ 15 75.0% 15 88.2%

CR 15 75.0% 15 88.2%

PR 0 0 0 0

SD 1 5.0% 0 0

PD 2 10.0% 1 5.8%

Прерывание 2 10.0% 1 5.8%

лечения

Выживаемость

Средняя PFS 36.0 месяцев (8.0-NR) 36.0 месяцев (8.0=NR)

2-ух летняя PFS

2-ух летняя OS

Среднее время наблюдения после лечения

65.8% (95% ДИ = 43.4%, 88.1%) 69.2% (95% ДИ = 46.7%, 91.7%)

68.4% (95% ДИ = 47.3%, 89.4%) 76.1% (95% ДИ = 55.6%, 96.5%)

21.0 месяцев (17.0-33.0)

Ответы на лечение были быстрыми и устойчивыми, что проявлялось видимой регрессией у пациентов с поражением кожи после лечения пероральным азацитидином и полным метаболическим ответом при промежуточном сканировании и сканировании после окончания лечения у пациентов с ответом на терапию.

При медиане наблюдения 21 месяц, медиана PFS оценивалась в 36 месяцев, а медиана OS не была достигнута. Двухлетняя PFS составил 65.8% (95% ДИ: 43.4%-88.1%) для всех субъектов и 69.2% (95% ДИ: 46.7%-91.7%) для подгруппы ПТКЛ-Т&. Двухлетняя OS составила 68.4% (95% ДИ: 47.3%-89.4%) для всех пациентов и 76.1% (95% ДИ: 55.6%-96.5%) для подгруппы ПТКЛ-Т& .

Корреляции показателя 1Р1 или экспрессии CD30 с ответом или выживаемостью не наблюдалось, за исключением того, что повышенный уровень ЛДГ коррелировал с неблагоприятным PFS (р=0.026 для всех пациентов, р=0.052 для подгруппы АИТЛ). Консолидирующая ТСК не повлияла на PFS или OS.

Поисковые исследования биомаркеров ответа и резистентности на азацитидин в качестве хемосенсибилизации у пациентов с ПТКЛ

Мутационные профили опухолей были описаны с помощью полного секвенирования экзома FFPE или свежезамороженных образцов биопсии опухоли после постановки диагноза ПТКЛ. Фармакодинамические эффекты приема азацитидина на экспрессию генов и метилирование ДНК в опухолевых клетках оценивали путем сравнения парных образцов, собранных на C1D-6 (до азацитидина) и C1D1 (до CHOP). Также оценивалось глобальное метилирование цитозина в лейкоцитах периферической крови.

На Рисунке 24 представлены все обнаруженные генетические нарушения в ключевых генах, наиболее часто задействованных в патогенезе Tfh подтипа ПТКЛ. WES было проведено у 17 пациентов, у которых были доступные образцы опухоли.

Рисунок 24 - - Онкоплот с патогенными генетическими событиями, обнаруженными в когорте пациентов с ПТКЛ.

Частоты мутаций TET2, RHOA, DNMT3A и IDH2 составили 76.5%, 41.1%, 23.5% и 23.5%, соответственно, при этом, мутации RHOA и IDH2 находились в горячих точках экзома (RHOA в G17V, IDH2 в R172G/S/T) (Рис. 25), что соотносится с данными литературы [79,148].

Рисунок 25 - Локализация мутаций в генах, важных для патогенеза ПТКЛ, которые были задетектированы в анализируемой когорте.

Поскольку мутации в IDH2 приводят к образованию 2-гидроксиглутарата и, следовательно, могут ингибировать активность фермента TET2, ожидалось, что IDH2 и TET2 будут взаимоисключающими событиями. Тем не менее, у 4 из 17 пациентов данные события сосуществовали, что также наблюдалось у Wang и соавторов [79].

Как видно на Рисунке 26 для всех пациентов мутации TET2 были достоверно связаны с CR (p = 0.007), благоприятной PFS (p = 0.004) и OS (p = 0.015), тогда как мутации DNMT3A были связаны с неблагоприятной PFS (p = 0.016). В подгруппе ПТКЛ-TFH мутации TET2 были связаны с благоприятной PFS (p = 0.014), тогда как мутации DNMT3A имели тенденцию к неблагоприятной PFS (p = 0.083).

I "И

£

1 «и

I

ttl-00-

IIci 4

Да 12

PTCL

it 12 mutaiiDii

Yes ----

No

Logrank p-0 004

PFS (месяцы) Ù

9 3

V PTCL-Т fli

ТЕТ2 mulation

Yes ----

No

Logrank p~00U

Нет 2

:ь i:

PFS (месяцы)

n

9 i

PTCL

ï 01-

S

Hei 12

Да 2

DNMT3A mulation

Yas----

No

Logrank p-0 016

PFS (месяцы) 9 3 2

9

i p- PTCL-Tfh

03-

i W- DNMT3A mirtalion

l s м- i Yes ---- No

Logrank p=0 083

00

» » PFS (месяцы) 40

Hei 12 9 3 2 0

Да 2

Рисунок 26 - Кривые Каплана-Мейера беспрогрессивной выживаемости в зависимости от наличия патогенных мутаций в генах TET2 и DNMT3A в когорте пациентов с ПТКЛ и в подтипе с ПТО^^.

У пациента PM2075 с ранним рецидивом после консолидирующей аутологичной ТСК была возможность анализа клональной эволюции путем секвенирования биопсии до начала лечения и после рецидива. Как видно на Рисунке 27, в образце после рецидива был обнаружен ранее недектированный клон, несущий мутацию DNMT3A R326C, что также подкрепляет наше предположение о том, что DNMT3A, может быть предиктивным биомаркером резистентности на терапию комбинацией азацитидина и CHOP.

Рисунок 27 - Анализ клональной эволюции пациента PM2075.

Фармакологические эффекты лечения азацитидином, связанные с влиянием на экспрессию генов и метилирование, оценивали с помощью секвенирования тотальной РНК и анализа RRBS в 6 парных образцах опухолей, собранных до и после лечения азацитидином перед химиотерапией CHOP. Был проведен анализ дифференциально экспрессируемых генов. Для этого использовались сигнатуры генов из публикаций Liberzon et al. 2015, Becht et al. 2016 и базы сигнальных путей KEGG [149,150], которые отражают ключевые биологические процессы. Гены с повышенной экспрессией из генных сигнатур приведены в Таблице 7.

Таблица 7 - Дифференциально экспрессированные гены в ответ на прайминг

азацитидином.

P value FDR Гены

Дифференциально сниженная экспрессия

В клетки 1.30E-17 1.90E-14 {'BLNK', 'ABCB4', 'MICAL3', 'CD19', 'MS4A1', 'GNG7', 'TCL1A', 'BACH2', 'BLK'}

Активация В клеток 1.40E-16 2.00E-13 {'MICAL3', 'CD19', 'MS4A1', 'GNG7', 'TCL1A', 'CLEC17A', 'BACH2', 'BLK'}

Маркеры В клеточного иммунофенотипа 5.30E-11 7.60E-08 {'CD19', 'MS4A1', 'PAX5', 'BANK1'}

Иммунодефицит 1.30E-07 0.00018 {'TNFRSF13B', 'CD19', 'BLNK', 'AICDA'}

BCR сигнализация 2.80E-06 0.0041 {'BLK', 'CD19', 'BLNK'}

Дифференциально повышенная экспрессия

TNa сигнализация через NFKb 7.90E-17 1.10E-13 {'NINJ1', 'CDKN1A', 'SIK1', 'KLF4', 'TRIB1', 'INHBA', 'FOSL2', 'FOSL1', 'MARCKS', 'ABCA1', 'RCAN1', 'ATF3', 'OLR1', 'HBEGF', 'NFE2L2', 'NAMPT', 'CEBPD', 'AREG', 'CCL2'}

Воспаление 4.30E-10 6.20E-07 {'SCN1B', 'CCL2', 'P2RY2', 'HRH1', 'OLR1', 'HBEGF', 'CDKN1A', 'AXL', 'ABCA1', 'NAMPT', 'MSR1', 'INHBA', 'EREG'}

Апоптоз; каспазный сигналинг 3.80E-09 5.50E-06 {'LUM', 'DCN', 'BGN', 'CDKN1A', 'DAP', 'TIMP2', 'HGF', 'MMP2', 'LGALS3', 'EREG', 'ATF3'}

Макрофаги 1.50E-07 0.00022 {'ME1', 'APOE', 'CTSK', 'CD163', 'MSR1'}

IL2 STAT5 сигналинг 3.80E-07 0.00055 {'NRP1', 'SPP1', 'SELP', 'IKZF2', 'DHRS3', 'PLIN2', 'CYFIP1', 'IL1R2', 'COL6A1', 'SNX9'}

Гипоксия, HIF1A таргеты 3.80E-07 0.00055 {'FOSL2', 'DCN', 'CDKN1A', 'RBPJ', 'ATF3', 'PLIN2', 'TGFBI', 'PGF', 'BGN', 'ANXA2'}

Как видно на Рисунке 28, анализ выявил обогащение сигнатур генов, связанных с апоптозом (p<0.01), гипоксией (p<0.01) и провоспалительными реакциями (p<0.01), включая интерферон I типа, TNF-a, активацию макрофагов и передачу сигналов IL-2. Данные результаты соотносятся с обнаруженными обогащенными сигнальными путями в работе Wong и соавторов [151].

Большое содержание В клеток в образцах ПТКЛ-ТШ является обычным явлением, что в некоторых случаях приводит к ошибочной дифференциальной диагностике с В-клеточной лимфомой или классической лимфомой Ходжкина. Кроме того, клональные и олигоклональные реаранжировки генов В-клеточных рецепторов обнаруживаются в 50% случаев, частично из-за экспансии ЕВУ в В-клетках [152]. В анализируемой когорте дифференциально экспрессируемые гены с пониженной экспрессией участвовали в путях активации и дифференцировки В-клеток. Снижение В клеточного сигналинга и В клеточных маркеров на фоне прайминга азацитидином может являться следствием ответа на терапию и прекращения патологических реакций герминативного центра [153].

повит йене О

снижение О

& ^ П

0.00018 и 5 5 и —

III а 3 ь

5 | 5 гс у

| I § I

. 1зг-ж - д: £ га 6р X

" & ь 5 § £

ОЙ 3* гг; - е. ^

■■■■■■ О 2 2 Й « В

ИИИИИ^И^И^И а а а < в

¡1 и в С 5 |

| £Ь д Н Я и | 0.ОМ1 ■

| г а 1 ■§• в 5 «««|

5 О < 3 I- = I

IТ ад 2

р £ —

{/1 и

Рисунок 28 - Дифференциально экспрессированные сигнатуры генов в ответ на прайминг азацитидином.

Далее был проанализирован состав биопсии с помощью метода деконволюции клеточных типов из данных RNA-seq (Рисунок 29а) и ЯКВЗ (Рисунок 29б). Как видно на Рисунке 29в, проценты клеточных типов, определенные из RNA-seq и RRBS, очень хорошо коррелируют друг с другом, что говорит о воспроизводимости результатов деконволюции.

Рисунок 29 - а. Деконволюция клеточных типов образцов ПТКЛ по ранным RNA-seq. б. Деконволюция клеточных типов образцов ПТКЛ по ранным RRBS. в. Корреляция Спирмена методов деконволюции из данных RNA-seq и RRBS.

Анализ экспрессии выявил тенденцию к снижению количества ТШ клеток (р = 0.18, Рис. 30а), Пролиферации (р = 0.18, Рис. 30б), а также клональности Р цепи Т клеточного рецептора (р = 0.10, Рис. 30в) в ответ на прайминг азацитидином.

0.0

СЮ-6 С101 С*Ю-6 СЮ1

Рисунок 30 - Гистограммы размаха для сигнатуры ТШ, клональности TCR и пролиферации до и после прайминга азацитидином.

На 6 парных образцах RRBS был проведен анализ метилирования ДНК. Как видно на Рисунке 31а, метилирование ДНК не показало значимого отличия в CpG-островках промоторов. Также не было обнаружено достоверного снижения метилирования всех СpG сайтов в ответ на прайминг азацитидином (Рис. 31б). Отсутствие значимого изменения метилирования в промоторных сайтах CpG и может быть связано с размером выборки. Глобальное метилирование цитозина в парных образцах лейкоцитов периферической крови (п = 9) показало достоверное фармакодинамическое снижение 5 - метилцитозина (р=0.04 по критерию Вилкоксона).

повышение снижение

C1D-6 C1D1 Ê1D-6 C1D3 ~20 ТсГ 0 TÔ 20

Разница в метилировании

Рисунок 31 - а. Среднее метилирование CpG сайтов промоторов до и после праймирования азацитидином. б. Среднее метилирование всех CpG сайтов до и после праймирования азацитидином. в. График различий метилирования CpG. Каждая точка представляет собой одну из более чем 1 000 000 сайтов CpG. Ось x показывает разницу между средним значением метилирования до и после лечения. Ось y логарифм от P-значения парного t-критерия.

На Рисунке 31в представлен график дифференциально метилированных CpG островков. Учитывая, что азацитидин является гипометилирующим агентом, мы ожидали преобладания низкометилированных CpG. Однако, наряду со значимо

сниженным метилированием некоторых CpG, мы наблюдаем сопоставимое количество значимо более метилированных CpG. Из этого можно сделать вывод, что эффект азацитидина скорее модулирующий, чем только гипометилирующий, что подтверждает работа исследовательской группы из Финляндии, показывающая, что ингибиторы DNMT увеличивают метилирование в клеточных линиях лимфомы [154].

Резюме к разделу 4.2

В данном исследовании показано, что добавление перорального азацитидина к CHOP в качестве терапии первой линии ПТКЛ безопасно, хорошо переносится и вызывает высокую частоту ответа, особенно в подтипе ПТКЛ с Tfh фенотипом. Механизм действия азацитидинового прайминга был исследован с помощью интегративного геномного, транскриптомного и метиломного анализов.

Мы наблюдали активацию генов, связанных с апоптозом и воспалением, включая интерферон типа I, TNF-a, активацию макрофагов и активацию сигналинга IL-2. Эпигенетическая индукция апоптоза и воспаления может повышать чувствительность микроокружения опухоли и способствовать противоопухолевому иммунитету. Кроме того, по-видимому, существует прямое ингибирующее действие азацитидина на клональные Т-фолликулярные хелперные Т-клетки и пролиферацию, измеренную с помощью деконволюции клеточных типов по данным RNA-seq.

Гипометилирование, вызванное азацитидином, было основным предполагаемым механизмом действия, однако небольшой размер выборки (n = 6) и гетерогенное микроокружение опухоли значительно ограничивали возможности анализа, в ходе которого не было обнаружено значительных изменений метилирования по данным RRBS.

Благоприятная ассоциация мутаций TET2 с выживаемостью идентифицирует потенциальный целевой биомаркер восприимчивости, в то время как мутации

DNMT3A были связаны с потенциальным прогрессированием и резистентностью к лечению, что требует дальнейшего изучения в более крупных исследованиях.

Таким образом, наше исследование демонстрирует, что добавление перорального азацитидина к CHOP в качестве начальной терапии ПТКЛ является безопасным, хорошо переносимым и вызывает высокую частоту ответа, особенно при подтипе ПТКЛ-Tfh. Данная комбинация продолжает исследоваться в межгрупповом рандомизированном исследовании фазы 2 ALLIANCE A051902, в котором сравнивают пероральный азацитидин в комбинации с CHOP/CHOEP , ингибитор PI3K дувелисиб в комбинации с CHOP/CHOEP со стандартной группой CHOP/CHOEP при CD30 отрицательной ПТКЛ (NCT04803201).

Представленные в данной главе результаты опубликованы в работе:

1. Ruan J., Moskowitz A., Mehta-Shah N., Sokol L., Chen Z., Kotlov N., Nos G., Sorokina M., Maksimov V., Sboner A., Sigouros M., Besien K., Horwitz S., Rutherford S., Mulvey E., Revuelta M., Xiang J, Alonso A., Melnick A., Lemento O., Inghirami G., Leonard J., Cerchietti L., Martin P. Multicenter Phase 2 Study of Oral azacitidine (CC-486) plus CHOP as initial treatment for peripheral T-cell lymphoma (PTCL) //Blood. - 2023. - V. 141 - №18. - С. 2194-2205.

4.3. БИОМАРКЕРЫ ОТВЕТА И РЕЗИСТЕНТНОСТИ НА ДУВЕЛИСИБ ИЛИ КОМБИНАЦИЮ С БОРТЕЗОМИБОМ ИЛИ РОМИДЕПСИНОМ У ПАЦИЕНТОВ С РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ИЛИ РЕФРАКТЕРНОЙ ПТКЛ

Одной из задач нашего диссертационного исследования было изучение прогностических биомаркеров ответа на терапию дувелисибом (Д) или комбинацией с бортезомибом (Д+Б) или ромидепсином (Д+Р) у пациентов с рефрактерной ПТКЛ из клинического исследования NCT02783625, используя WES и RNA-seq. Результаты 1-ой фазы доложены в 2018 году Horwitz и соавторами [155],

промежуточные результаты 2-ой фазы клинического испытания приведены в работе коллабораторов [156].

Для анализа биомаркеров с помощью WES и RNA-seq было включено 55 пациентов с ПТКЛ и 11 пациентов с ТКЛК. В Таблице 8 приведены морфологические диагнозы пациентов, включенных в поисковое исследование биомаркеров, и уровень ответа для каждого подвида ТКЛ.

Таблица 8 - Стратификация пациентов по диагнозам и уровню ответа.

Морфологический диагноз Всего Поддавались оценке ответа ORR N (%) CR N (%) Аллогенна я ТСК N (%)

ПТКЛ 55 53 31 (58) 22 (42) 15 (28)

ПТКЛNOS 20 19 10 (53) 6(32) 3(16)

АИТЛ^Н подтип 19 19 13 (68) 11 (58) 7 (37)

у5 ТКЛ 3 3 1(33) 1(33) 1(33)

АКТЛ 3 3 3 (100) 2 (67) 2 (66)

ГЛТКЛ 2 2 1(50) 0 1(50)

Агрессивная эпидермотропная CD8+ ТКЛ Другие ТКЛ 2 6 2 5 1(50) 2 (40) 1(50) 1(20) 0 1(20)

ТКЛК 11 11 4 (36) 0 0

Грибовидный микоз 7 7 2 (29) 0 0

Крупноклеточная трансформация 3 3 0 0 0

Синдром сезари 4 4 2(50) 0 0

Крупноклеточная трансформация 1 1 0 0 0

Всего

66

64

35 15(23)

(55) 22 (34)

64 из 66 пациентов подлежали оценке ответа. ORR составила 55%, а CR — 34%. При ПТКЛ ORR составила 58%, а CR — 42%. Все пациенты с ТКЛК продемонстрировали частичный ответ, ORR составила 36%. Из 35 ответчиков 15 приступили к аллогенной ТСК. Средняя PFS составила 6,9 месяца для ПТКЛ и 5,5 месяца для ТКЛК. Средняя продолжительность ответа составила 8,1 месяца. Четыре субъекта продемонстрировали полный ответ при приеме дувелисиба и не переходили к комбинации дувелисиб + ромидепсин; 2 из 4 отправились на ТСК и один продолжил принимать дувелисиб в течение 42 месяцев.

В лаборатории было выполнено полноэкзомное секвенирование на 75 образцах опухолей, из которых 49 также имели парные WES нормальной ткани. Образцы WES, взятые до начала терапии, были доступны для 43 пациентов (25 ПКТЛ, 18 ТКЛК). В дополнение к анализу взятых до начала терапии образцов выполнен динамический WES анализ образцов (во время лечения, в конце лечения или в обоих случаях) для 12 пациентов.

Также было проведено секвенирование РНК опухолевых биопсий и проведен дальнейший анализ на 120 образцах, взятых из различных тканей: лимфатических узлов, костного мозга, периферической крови, кожи и др. Проведя контроль качества, мы смогли отобрать для дальнейшего анализа 56 образцов (36 ПТКЛ, 20 ТКЛК) с высоким содержанием опухоли, из которых 23 (16 ПТКЛ, 7 ТКЛК) были взяты до начала терапии, 13 (9 ПТКЛ, 4 ТКЛК) были собраны во время первичной терапии дувелисибом, 8 взяты у пациентов, принимавших комбинацию дувелисиб + ромидепсин, и 10 были взяты в конце лечения.

Для визуализации генетических находок у пациентов до начала терапии (N=43) были вручную отобраны гены, которые наиболее часто подвержены мутациям или нарушения копийности у пациентов с ПТКЛ. На рисунке 32a, б представлены онкоплоты с найденными событиями для ПТКЛ и ТКЛК.

Рисунок 32 - а. Онкоплот с ландшафтом драйверных мутаций для когорты ПТКЛ. б. Онкоплот с ландшафтом драйверных мутаций для когорты ТКЛК.

Нами выявлена высокая частота мутаций в известных ПТКЛ-ассоциированных генах: ТЕТ2 (ТКЛК: 6%, ПТКЛ: 40%), БЫМТЗА (ТКЛК: 17%, ПТКЛ: 8%), RHOA (ТКЛК: 6%, ПТКЛ: 12%), УАУ1 (ТКЛК: 11%, ПТКЛ: 8%) и ТР53 (ТКЛК: 11%, ПТКЛ: 12%).

Как видно на рисунке 32а, мутации ТЕТ2 были в значительной степени связаны с ответом при ПТКЛ (9/13 Я против 1/12 КЯ, р = 0.0036). Мутации в КНОА или УАУ1 были выявлены исключительно у ответчиков (7/21 Я против 0/22 КЯ, р = 0.002). Напротив, мутации в ТР53 (0/13 Я против 3/12 КЯ, р = 0.2) у пациентов с ПТКЛ были связаны с отсутствием ответа.

Реконструкция клеточного состава биопсий выполнена для всех образцов у которых была в наличии РНК, прошедшая контроль качества. Как видно на Рисунке 33 до данным деконволюции выделяются три группы образцов: с высоким содержанием моноцитов (биопсии костного мозга и крови), с высоким содержанием Т клеток (преимущественно биопсии лимфатических узлов) и с низким содержанием Т клеток (преимущественно биопсии кожи). Так как некорректно проводить анализ ОМО по биопсиям костного мозга и крови, данные образцы были

исключены из дальнейшего анализа. Также некорректно анализировать образцы в которых низкое содержание опухоли. Содержание опухоли коррелировало с содержанием Т клеток в образце. Образцы с процентом опухоли по данным WES меньше 15% также были исключены из анализа ОМО.

тгу .. t Т клеток 1 Т клеток

Костный мозг

Рисунок 33 - Клеточная деконволюция образцов по данным RNA-seq

На рисунке 34а приведен анализ клеточной деконволюции образцов взятых до начала терапии. Было установлено более высокое содержание В-клеток в исходных биопсиях у ответчиков по сравнению с неответчиками (Рисунок 55б; р = 0.008). Однако данная находка может быть связана с превалирующим сайтом биопсии у ответчиков (лимфатические узлы), в которых содержание В клеток в принципе выше по сравнению с кожей. Для валидации данной находки необходимо увеличение выборки с унифицированным сайтом биопсии, а также проведение ИГХ. Также по данным деконволюции виден тренд большего содержания фибробластов в исходных биопсиях у неответчивов (Рисунок 34в; р = 0.07), что может указывать на стромальный тип ОМО, который, по данным литературы, может является неблагоприятным для ПТКЛ в плане общей выживаемости [157].

а б в

Рисунок 34 - а. Клеточная деконволюция биоптатов до начала терапии. б. Гистограмма размаха процентного количества В клеток в ОМО в зависимости от ответа. в. Гистограмма размаха процентного содержания фибробластов в ОМО в зависимости от ответа.

Для поиска достоверных изменений в экспрессии генных сигнатур на фоне лечения была проведена логистическая регрессия. На Рисунке 35 приведены гистограммы размаха, показывающие динамику экспрессий генных сигнатур у ответчичов и неответчиков. Отмечено значительное снижение количества клеток (р <0.004 у R; р = ns у КЯ), скорости пролиферации (р <0.002 у R; р=ш у КЯ) и увеличение лимфатического эндотелия (р<0.05 у Я; р=ш у КЯ). Транскрипционные сигнатуры для сигнального пути Р13К уменьшились к концу лечения по сравнению с исходным уровнем у ответчиков (р <0.009), но не у неответчиков (р = ш).

Рисунок 35 - Динамика экспрессий генных сигнатур (Progeny score)

Повышение активности Р13К пути в точке после окончания лечения у ответчиков может быть связана с тем, что биопсия, в подавляющем большинстве случаев, бралась лишь у той части пациентов, у которой возникал рецидив лимфомы. Для проверки нашей гипотезы мы провели анализ дифференциальной экспрессии у ответчиков. Как видно на Рисунке 36, достоверно выше экспрессирован сигнальный путь, опосредованный ГЬ6 и NFkB, что подтверждает предположение об активации альтернативных механизмов во время рецидива. Также обращает на себя внимания сигнатура дифференцировки фенотипа Т клеток в ТЫ и ^2 дендритными клетками, что может говорить о смене фенотипа опухолевых Т клеток.

Рисунок 36 - Дифференциально экспрессированные сигнатуры генов у ответчиков в зависимости от временной точки взятия биопсии (во время лечения комбинаций Д+Б/Д+Р и во время рецидива).

Также мы провели сравнение исходного уровня экспрессии данных сигнатур в зависимости от ответа на терапию. На Рисунке 37 видно, что у пациентов ответивших на дувелисиб или комбинацию была незначимо выше активность PI3K сигнального пути (p=0.08), а сигнатура T фолликулярных хелперов достоверно была повышена у ответчиков (p<0.001). Количество лимфатического эндотелия и уровень пролиферации до начала лечения не отличался у ответчиков и неответчиков. Ранее в работе Ghione и соавторов отмечалось, что HDAC ингибиторы показывают больший процент ответа в когорте ТКЛ с Tfh фенотипом [158]. Авторы определяли Tfh фенотип с помощью ИГХ или цитометрии при позитивности как минимум двух маркеров (CD10, CD279 (PD1), CXCL13, ICOS, SAP, CCR5 и BCL6).

Рисунок 37 - Гистограммы размаха, показывающие уровень экспрессии сигнатуры Т фолликулярных хелперов и Р13К сигнального пути до начала лечения у ответчиков и неответчиков.

Резюме к разделу 4.3

Пациенты с рецидивирующей ТКЛ до сих пор остаются неблагоприятной по прогнозу категорией больных, рефрактерных к ритуксимабу и стандартной химиотерапии. Результаты исследования КСТ02783625 продемонстрировали, что двойной механизм ингибирования Р13К-5,-у открывает новые терапевтические возможности для таких пациентов.

Перед нами стояла задача провести ретроспективной поиск биомаркеров ответа и резистентности на дувелисиб или комбинацию с ромидепсином или бортезомибом. С помощью методов секвенирования следующего поколения в ходе анализа экзома была обнаружено, что мутации ТЕТ2, RHOA и VAV1 были в значительной степени связаны с ответом, в то время как альтерации гена ТР53 были выявлены исключительно у неответчиков с ПТКЛ. Методом RNA-seq показано более высокое содержание В-клеток в исходных биопсиях у ответчиков по сравнению с неответчиками. Экспрессионные сигнатуры для сигнального пути Р13К уменьшились к концу лечения по сравнению с исходным уровнем исключительно у

ответчиков. Для определения механизмов ответа в данной работе выполнен анализ дифференциальной экспрессии, показавший активацию отличных от Pi3k сигнальных путей у неответчиков.

Результаты интегрированного геномного и транскриптомного анализа свидетельствуют о том, что отбор пациентов с учетом биомаркеров может еще больше улучшить ответ пациентов с рефрактерной ПТКЛ при лечении дувелисибом или комбинацией.

Представленные в данной главе результаты опубликованы в работе:

1. Horwitz S., Nikitina A., Kotlov N., Ajit N., Ran X., Bagaev A., Sorokina M., Degryse S., Moskowitz A., Mehta-Shah N., Jacobsen E., Khodadoust M., Ganesan N., Drill E., Hancock H., Davey T., Myskowski P., Maccaro C., Blouin L., Perez L., Ryu S., Galasso N., Dogan A., Fowler N., Kim Y.., Weinstock D. The combination of duvelisib and romidepsin (dr) is highly active against relapsed/refractory peripheral T-cell lymphoma with low rates of transaminitis: final results and biomarker analysis // Blood. - 2021. Atlanta, GA. Abstract 619.

4.4. БИОМАРКЕРЫ ОТВЕТА И РЕЗИСТЕНТНОСТИ НА ТЕРАПИЮ CD19 CAR T КЛЕТКАМИ У ПАЦИЕНТОВ С РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ИЛИ РЕФРАКТЕРНОЙ ДВККЛ

Как обсуждалось в литературном обзоре, исследования ОМО и анализ экзома в лимфомах позволяют предположить, что тип ОМО, а также изменение генома может быть предиктором ответа на терапию CD19 CAR T клетками. В данной работе, для поиска биомаркеров ответа и резистентности, выполнена оценка соматических мутаций, нарушений копийности и профиля ОМО с помощью WES и RNA-seq для пациентов с рефрактерной ДВККЛ, получавших терапию CART19.

Клинико-демографическая характеристика и наблюдаемые нежелательные явления исследуемой когорты были ранее доложены в работе коллабораторов [159].

У 49 пациентов общий ответ на CD19 CAR T терапию через 3 месяца составил 77.6% (59.2% CR, 18.4% PR), а PFS через 6 месяцев составила 49%. У 37% пациентов отмечена трансформированная ДВККЛ с общим ответом через 3 месяца 89% (61% CR, 28% PR), а PFS через 6 месяцев составила 61%.

Нами проанализированы данные WES и RNA-seq на 54 образцах опухолей от 49 пациентов с рецидивирующей и рефрактерной ДВККЛ. 30 пациентов получали axicabtagene ciloleucel (axi-cel), 18 - tisagenlecleucel (tisa-cel) и 1 - lisocabtagene maraleucel. У 41 пациента образцы были собраны до терапии CART19, у 13 пациентов - после терапии, из них у 5 пациентов были парные образцы (до и после CART19).

WES c удовлетворительными параметрами контроля качества получено в 49 образцах от 44 пациентов. RNA-seq успешно проведено в 51 образце от 47 пациентов.

В рамках данной работы мы также оценивали прогностическое значение некоторых параметров ПЭТ/КТ с ^-фтордезоксиглюкозой, а также ряд лабораторных показателей. На рисунке 15 представлены диаграммы размаха, по данным которых получено подтверждение прогностического значения таких биомаркеров терапии CART, как повышенная ЛДГ (Рис 38а; p = 0.01), SUVmax (Рис 38б; p = 0.02) и повышение MTV (Рис 38в; p = 0.02). Увеличенный размер ЛУ также чаще наблюдался у неответчиков (Рис 38г; p = 0.06). SUVmax, а также повышение MTV, ЛДГ и размера ЛУ были достоверными предикторами худшей PFS, как видно на кривых Каплана-Мейера на рисунке 38д-з.

0 0 10 20 30 0 0 10 20 30 0 0 10 20 30 0 0 10 20 30

Месяцы Месяцы Месяцы Месяцы

Рисунок 38 - Гистограммы размаха, показывающие уровни ЛДГ (а), SUVmax (б), MTV (в) и максимального размера ЛУ (в) у ответчиков и неответчиков. Кривые Каплана-Майера безрецидивной выживаемости в зависимости от величины параметров ЛДГ (д), SUVmax (е), MTV (ж) и максимального размера ЛУ (г).

Другие анализируемые параметры не показали достоверной связи с PFS и ответом на CART19.

Анализ экзома

Для визуализации генетических находок были вручную отобраны гены, которые наиболее часто подвержены мутациям или нарушения копийности у пациентов с ДВККЛ. На рисунке 39 представлен онкоплот с найденными событиями. Наиболее часто в когорте встречались соматические мутации в генах, кодирующих гистон-модифицирующие ферменты, такие как мутации с потерей функции гистонметилтрансферазы (histone methyltransferase, HMT) KMT2D, мутации с усилением функции HMT EZH2, а также мутации с потерей функции гистоновых ацетилтрансфераз CREBBP и EP300. По данным литературы, данные соматические

мутации эпигенетических регуляторов встречаются примерно у 50% пациентов с ДВККЛ [160] и считаются исходными событиями, которые предрасполагают нормальные В-клетки к злокачественной трансформации.

Рисунок 39 - Онкоплот с патогенными генетическими событиями, обнаруженными в когорте пациентов с ДБККЛ.

Из всех обнаруженных мутаций, лишь у CREBBP была достоверная связь с ответом на CART19. На рисунке 40 представлены сайты мутаций в гене CREBBP, обнаруженных в исследуемой когорте. Обнаружение данной мутации в биопсии перед началом лечения, может говорить об увеличении безрецидивной выживаемости (p = 0.03) и вероятном успехе терапии (Рисунок 41б). CREBBP - это ген, кодирующий CREB-связывающий белок (CREB binding protein). Белок CREBBP содержит домен с гистонацетилтрансферазной активностью (histone athethyl transferase, НАТ), который ацетилирует гистоны и другие белки (Рисунок 18).

Рисунок 40 - Мутации в гене СКЕВВР, обнаруженные в когорте. Темно-серым показаны белковые домены.

По данным литературы, CREBBP c большой долей вероятности является онкосупрессором [161], поэтому мутации с потерей функции часто выступают драйверными событиями в В-клеточных лимфомах. При мутации CREBBP нарушается его способность катализировать ацетилирование TP53, а также ацетилировать и инактивировать функцию BCL6, способствуя злокачественной трансформации В-клеток герминального центра [162].

При анализе нарушений копийности была обнаружена достоверная связь амплификаций гена PIK3CA с увеличении PFS (p = 0.04), рисунок 41а. PIK3CA является онкогеном. В более ранних исследованиях сообщалось, что ДВККЛ зависит от конститутивного PI3K сигналинга для блокирования апоптоза [163]. Увеличение числа копий PIK3CA приводит к усилению пролиферации и, по данным литературы, является событием, которое ассоциировано с уменьшением общей выживаемости у пациентов с ДВККЛ [164]. Тем не менее, в настоящей когорте нами обнаружена связь амплификации PIC3CA c увеличением безрецидивной выживаемости после инфузии CD19 CAR T клеток.

Рисунок 41 - а. Кривые выживаемости без прогрессии Каплана-Мейера при амплификации гена Р1К3СА (амплификация или дикий тип). Б. б. Кривые выживаемости без прогрессии Каплана-Мейера при мутации гена CREBBP (патогенная мутация или дикий тип).

Анализ транскриптома

Для анализа опухолевого микроокружения мы использовали сигнатуры и типы опухолевых портретов от [129]. Как видно на Рисунке 42 ,были обнаружены все 4 типа микроокружения при анализе РНК биопсий взятых до инфузии CD19 CAR T клеток: GCB (N = 2), стромальный (N = 20), инфильтрированный (N = 4) и исключенный (N = 14).

Рисунок 42 - Хитмап когорты пациентов с рефрактерной ДВККЛ. Благоприятные подтипы ОМО продемонстрировали лучшую OS по сравнению с неблагоприятными подтипами ф = 0.02).

При анализе влияния микроокружения на общую выживаемость когорта была разделена на 2 типа ОМО: благоприятное (GCB и стромальное) и неблагоприятное (инфильтрированное и исключенное). Как видно на кривых Каплана-Мейера (рис. 12). Благоприятные подтипы ОМО продемонстрировали более высокую ОВ по сравнению с неблагоприятными подтипами (Рисунок 43а, p = 0.02). Достоверной связи с безрецидивной выживаемостью обнаружено не было (Рисунок 43б, p = 0.4).

Рисунок 43 - Кривые Каплана-Мейера общей выживаемости в зависимости от типа ОМО у пациентов с рефрактерной ДВККЛ.

В ходе анализа экспрессии сигнатур и отдельных генов было обнаружено, что МНС11 сигнатура коррелировала с ответом на CART19 в подтипе GCB-ДВККЛ (Рисунок 44а, р = 0,03) (рис. 4а). Активация МНС11, вероятно, связана с центроцитоподобным фенотипом [165]. Это подтверждается более высокой сигнатурой генов, связанных с центроцитами В-клеток, в GCB у ответчиков по сравнению с неответчиками (Рисунок 44б, р = 0,02). Анализ дифференциальной экспрессии генов также выявил более высокую экспрессию генов МНС11 в подтипе GCB-ДВККЛ, а также среди пациентов, у которых ДВККЛ развилась из трансформированной ФЛ. У пациентов с ДВККЛ метилирование гена SMAD1 может привести к инактивации сигнального пути TGF-P и снижению хемосенсибилизации [88,166]. SMAD1 был подавлен в образцах с истощенным типом ОМО, в то время как высокая экспрессия наблюдалась у пациентов с АВС (р = 0,003) и GCB (р = 0,06) подтипом ДВККЛ , которые достигли PFS через 6 месяцев от инфузии СДЯТ19 (Рисунок 44в).

я. MHCII [GCB подтип] fi. Сигнатура центроцитов [ABC+GCB] в. SMAD1 [ABC подтип]

Месяцы

Рисунок 44 - а. Гистограммы размаха сигнатуры MHCII у ответчиков и неответчиков среди подтипа GCB-ДВККЛ. б. Кривые Каплана -Мейера безрецидивной выживаемости по медианному значению экспрессии сигнатуры центроцитов (база сигнатур BAGS). в. Гистограммы размаха SMAD1 экспрессии у ответчиков и неответчиков среди подтипа АВС-ДВККЛ. R — ответчики, NR — неответчики.

Реконструкция клональной эволюции

Ранее нами уже была показана применимость реконструкции клонального состава опухоли для характеризации внутриопухолевой гетерогенности на примере пациента с тимомой [167]. Клональная эволюция - это важнейший фактор, обеспечивающий выживание опухолевых клеток в ходе терапии, приводя в итоге к развитию рецидивов. Недавние исследования неходжскинских лимфом показали, что клинический рецидив часто вызывается нарастанием более агрессивного субклона, который либо не был детектирован, либо отсутствовал в биопсии до лечения [168]. Несмотря на тот факт, что изначальный генетический профиль пациентов с ДВККЛ уже идентифицирован достаточно глубоко [160], данных о прогностической роли и о механизмах клонального эволюции по-прежнему мало. Прямое сравнение опухоли до и после рецидива заболевания зачастую невыполнимы в клинической практике из-за отсутствия 'пост' биопсии или из-за технических ограничений, связанных с формалиновой фиксацией. На примере двух пациентов, у которых были парные

WES с высоким покрытием, мы пытаемся исследовать молекулярные паттерны рецидива (пациент 1020; Рис 45) и ответа (пациент 1008; Рис 46) на CART19 терапию.

Пациент 1020; Мужчина, 68 лет; ABC; Triple-hit

Потенциальный механизм рецидива к CAR-T может заключаться в потери функции B2M.

Рисунок 45 - Анализ клональной эволюции пациента 1020.

Молекулы НЬА I класса экспрессируются на поверхности всех ядерных клеток и представляют антигенные пептиды цитотоксическим Т-клеткам, тем самым играя важную роль в инициации клеточного противоопухолевого иммунного ответа. Влияние мутации легкой цепи молекулы НЬА класса I, в2-микроглобулина (в2т) у пациентов с ДВККЛ приводит к потере экспрессии [169] и может рассматриваться в качестве гена-кандидата, связанного с рецидивированием и химиорезистентностью [170].

Таким образом, потеря экспрессии HLAI класса на поверхности опухолевых B клеток может наделять лимфому способностью избегать эффективной иммунной атаки хозяина (immune escape/evasion) в том числе и от аутологичных или аллогенных Т-лимфоцитов, которые подверглись ex vivo генетической модификации и экспрессируют на своей мембране химерный антигенный рецептор, способный узнавать нео-антигены и связываться с поверхностным антигеном CD19.

Стоит отметить, что подтип ОМО также изменился с более прогностически благоприятного стромального подтипа на менее благоприятный исключенный.

Пациент 1008; Мужчина, 75 лет; ABC; Triple-hit

Рисунок 46 - Анализ клональной эволюции пациента 1008.

Недавние исследования в области клональной эволюции связывают тип появления новых мутаций при ОМЛ с прогнозом и ответом на таргетную терапию [171]. Как правило, выделяют ветвящийся (появление новых мутаций в рамках отдельных субклонов с отличной от клона частотой встречаемости аллеля (variant allele frequency, VAF) и линейный тип клональной эволюции (накопление мутаций в

рамках одного опухолевого клона; схожий VAF). Исследования, показывающие связь типа эволюции с ответом на терапию или прогнозом, на настоящий момент отсутствуют в ДВККЛ. Однако стоит отметить, что у пациента 1008 (ответчик), мы наблюдаем 2 четких субклона по данным VAF обнаруженных мутаций, что говорит о ветвящемся типе. Касаемо типа ОМО, у пациента 1008 он сменился с исключенного на стромальный. По данным деконволюции наблюдается снижение процента B-клеток (вероятно опухолевых), что соответствует меньшему VAF детектированных мутаций.

Резюме к разделу 4.4.

Несмотря на то, что большинство пациентов с впервые диагностированной ДВККЛ излечивается с помощью первой линии химиоиммунотерапии (R-CHOP) [172], примерно 30% имеют рецидив или рефрактерную болезнь. Трансплантация аутологичных CD19 CAR-T клеток привела к беспрецедентным результатам, показав частоту ответов более 70% в данной популяции. Однако более 60% реципиентов CD19-CAR-T в конечном итоге прогрессируют [130,131,173-175].

Нами была предпринята попытка найти биомаркеры ответа и резистентности с помощью методов секвенирования следующего поколения. В ходе анализа экзома была обнаружено 2 биомаркера беспрогрессивной выживаемости (амплификация PIK3CA и мутация CREBBP) у пациентов с ДВККЛ, получавших инфузию CD19 CAR T клеток.

При анализе транскриптома отмечена повышенная экспрессия сигнатуры MHCII и сигнатуры центроцитоподобных клеток у ответчиков с GCB-подтипом, что может говорить об эндогенном потенцировании TCR опосредованного иммунитета за счет активации CAR.

Анализ клональной эволюции пациентов с биопсиями до и после лечения выявляет потенциальные механизмы устойчивости к CART19.

Таким образом, комплексный молекулярный анализ ОМО и геномных

изменений дает ценную информацию о коррелятивных биомаркерах ответа на иммунотерапию CART19 у пациентов с рефрактерной ДВККЛ. При дополнительном анализе большей когорты эти биомаркеры ответа на терапию CART19 могут помочь в составлении планов клинического лечения, минимизации нежелательных явлений или разработке новых терапевтических подходов.

Представленные в данной главе результаты опубликованы в работах:

1. Batlevi C., Nos G., Kotlov N., Sorokina M., Okwali M., Bagaev A., Michaud L., Gunjan L., Shouval R, Tomas A, Ewalt M., Belova E., Degryse S., Tazearslan C., Podsvirova S., Love A., Postovalova E., Fowler N., Perales M., Schoder H., Dogan A., Arcila M., Salles G., Sauter C. Correlative Biomarkers for CART19 Response in Patients with Relapsed or Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma //Blood. -2022. - V. 140. - №. Supplement 1. - P. 9228-9230.

2. Nabel C., Hung Y., Kurilovich A., Lopareva A., Dias-Santagata В., Batashkov N., Tabakov D., Sorokina M., Makarov A., Sagaradze G., Butusova A., Kudryashova O., Bedniagin L., Wright С., Shin N., Bagaev A., Postovalova E., Louissaint A. Longitudinal molecular analysis of tumor exome and transcriptome to evaluate clonal evolution and identify novel therapeutic targets in thymoma //JCO Precision Oncology. - 2023 - V. 7. - P. E2300107.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

NGS произвело революцию в области онкологии и дает быстро растущее представление о патомеханизмах резистентности к лечению. Методы секвенирования следующего поколения (NGS), завоевывающие все большие позиций в медико-биологических исследованиях, позволяют с высокой чувствительностью обнаружить множественные генетические аномалии. Исследования показали, что NGS позволяет одновременно выявлять мутации в нескольких сотнях ампликонов с очень высокой чувствительностью, а также предоставляет важнейшую информацию об устройстве микроокружения опухоли [48]. Точный молекулярно-генетический диагноз имеет решающее значение для генетического консультирования, предоставляет информацию о риске рецидива и может помочь улучшить клиническое ведение пациентов.

Однако важными недостатками использования NGS, лимитирующими широкое внедрение этого метода в клиническую практику, являются технологическая сложность, высокая стоимость оборудования и расходных материалов, длительность тестирования, отсутствие стандартизированных методик и общепризнанных вычислительных алгоритмов. Также узким местом в области генетической диагностики является процесс интерпретации полученных генетических и транскриптомных данных, что, безусловно, является одним из наиболее трудоемких частей анализа. Справиться с этим можно только с помощью мультидисциплинарной команды, объединяющей аналитиков, биоинформатиков, генетиков и клиницистов.

Цель данного исследования - изучить возможность применения секвенирования следующего поколения для оценки биомаркеров ответа и резистентности на новые виды терапий в онкологии.